利用全自动蛋白芯片检测法验证热加工肉及含肉制品HACCP实施中的加热效果

上海出入境检验检疫局  张 柳    韩 伟

 

 

摘 要 近年来我国出口至日本的热加工禽肉、偶蹄类产品多次被日本农林水产省查出加热不充分，相关企业被令出口暂停，而判定依据是对出口样品实施的可溶性蛋白SDS-PAGE电泳图谱比对结果。我国对输日相关产品尚未推广利用变性蛋白电泳检测法来推断产品的受加热程度，技术层面的落后使我们在中日贸易双方谈判中处于被动状态。本文从背景、意义、检测原理、操作方案等角度研究了全自动蛋白芯片检测法做为热加工肉及含肉食品HACCP实施中的加热效果验证措施的可行性和展望前景。

 

关键词 热加工肉及含肉食品   技术壁垒    HACCP     蛋白变性      全自动蛋白芯片检测  

 

肉及含肉制品加工企业通常以杀灭特定致病性微生物为目的，通过蒸、煮、油炸或其他方式将经处理后的肉及含肉制品加热，并达到无致病性微生物和相关法规的安全卫生要求。正是由于热加工是一种非常有效的生物危害控制措施，因而得到了大多数生产企业的关键性重视---被确立为加工中的关键控制点。那么如何对此关键工序的执行效果进行验证呢？综合来讲，加热过程中对监控人员的监控行为直接进行观察、审核加热过程记录、对加热设备及其关键参数显示、记录设施进行校准、对加热工艺进行确认、对加热后产品做微生物检测等方法都是可行且必须的热加工效果验证措施。但是，近年来我国出口至日本的热加工禽肉、偶蹄类产品多次被日本农林水产省检测出加热不充分，相关企业被令出口暂停的事件，使我国对日出口热加工偶蹄类、禽肉类产品再次面临着严峻的技术贸易壁垒形势。当日方检测部门出具加热不充分样品中变性蛋白电泳分析检测结果时，我们无法质疑且只能全盘接受，因为我们的检测技术滞后了！因此，研究和建立一个直接、精确的检测热加工肉及肉制品加热程度的方法，不但可以改变当前我们在此项检测方面的不利处境，从而在应对贸易壁垒中不再无语和哑然，更可以为我国进口食品筑起一道技术高墙。

攻守两易的技术贸易壁垒政策，让我们开始了对基于蛋白质变性的分子生物学原理而建立的凝胶电泳法的关注。

 

热加工肉及含肉制品加热效果验证的传统方法与新方法

很多研究表明，加热过程中肌肉的变化与加热终点温度之间存在联系，如肌肉颜色、组织结构和蛋白质性质、酶活性的变化等。根据这些变化，已有多种验证加热效果的产品检测方法被开发和建立起来。

常规的产品加热效果验证方法主要是感官检测，即颜色、组织形态的判别法。动物肌肉的肌红蛋白加热到65℃-80℃时会变性，使肌肉颜色倾向棕色，目测及可见分光光度计均可进行判断；而加热引起的肌肉组织的结构变化如肌纤维的收缩崩解等也可通过目测判断。另外，骨髓凝固、血水消失等常识也被用于判定产品是否被充分加热的感官指标。感官检测具有简便易行，快速直观的特点，但其结果对经验依赖性较大，一般难于量化，准确性有波动；另外，结果随感官检验施行人员不同而存在较为显著的个体判断差别。

天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，称为变性(denaturation)。动物肌肉富含蛋白质，加热主要是破坏蛋白质分子中的氢键，导致其溶解度降低，粘度增加，结晶性破坏，酶活性发生变化。根据加热过程中蛋白质的这些变化特点，通过检测不同加热程度的热变性蛋白分子量便可对加热终点温度得出间接推断。相关的方法有可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳、Western-Blot法、蛋白凝聚试验、特定的酶活性测定以及对指示蛋白的免疫学检测等。综合方法的简便性、重复性和稳定性，蛋白质的凝胶电泳分析不失为一种有效的验证肉类加热程度的方法。而随着新方法的完善，半自动与全自动的检测仪器也有了较高的商业化程度，如微流芯片分离电泳的新产品ExperionTM全自动电泳系统结合相应的蛋白芯片, 可在30分钟内快速全自动完成整个蛋白电泳及条带分析。将其应用于加热变性蛋白的检测，可迅速有效地判断加热终点温度是否达到加工工艺和相关法规的要求，从而为HACCP实施提供了科学、便捷的有效性验证方法，尤其适合作为官方验证的一种举措。

 

全自动蛋白芯片检测与监测加热程度的方法的具体步骤与结果

[材料]

样品制备用仪器与试剂

PBS(0.01mol/L)；天平；Bagmixer击拍器及Bagpage样品袋；刻度吸管；低温离心机；离心管；记号笔；中心温度计等

Experion™ 系统 自动电泳工作站和制胶工作站

试剂盒，包括微流芯片和用于蛋白质分析的试剂，可分辩并定量从10到260 kD大小的蛋白质样本

电脑配置：Pentium 4，2GHz，512 K RAM，Windows 2K或XP，多重USB接口

样品来源

热加工含偶蹄类肉、禽肉类食品，包括不同加热方式、不同加热阶段的半成品与成品样品

[方法步骤]

样本制备

将待检的不同加热程度食品样品剪成大约10g左右，放入Bagpage样品袋中，添加90mL PBS；

用Bagmixer击拍器击拍10min后静置0.5hr；

取上清液，8000rpm低温离心20min；

取离心上清液1mL，加入微量离心管，每管1mL，做标记；

再在8，000rpm低温离心 5min，备用。

2、芯片的制胶和加样

1）使用前，所有试剂盒中的试剂达到室温平衡，并轻轻振荡混匀；

2）按蛋白质分析试剂盒的使用手册要求制胶和制样。

3）将样本和分子量标记加入到芯片中，缓慢的加入芯片试剂，避免引入气泡。

3、运行分析

1）点击电脑桌面上的Experion图标，运行软件；

2）将制胶并加样的芯片应立即或在5分钟内放入自动电泳工作站中的芯片平台上，固定妥当，合上盖子；

3）按操作界面要求运行分析，波峰/电泳图谱和胶视图均可显示，以监测运行的进展结果。

[结 果]

不同加热情况的偶蹄类肉、禽肉食品的蛋白质变性情况

1）蒸汽加热

样品1：蒸制鸡腿肉串（蒸前45G）

加热方式与CCP要求：肉串进入蒸箱内，100℃蒸汽蒸12分钟，肉中心温度达到70℃以上并保持1分钟以上。

 

样品2： 35克小肉包（猪肉）

加热方式与CCP要求：肉包进入蒸箱，100℃蒸汽蒸制10分钟，肉中心温度达到70℃以上并保持1分钟以上。

 

2）油炸加热

样品：裹浆油炸鸡腿肉块

加热方式与CCP要求：第一次油炸（棕榈油）160℃80秒；经过10秒输送带后，进行第二次油炸，165℃135秒；肉中心温度为70℃以上并维持1分钟以上。

 

3）烤制加热

样品：烤牛舌片

加热方式：电烤720度3分钟。

 

[讨 论]

Experion™ 全自动蛋白芯片检测系统是一种基于荧光电泳的蛋白质测定方法。将其应用于禽、肉制品中加热变性蛋白的检测具有快速、简单、高效等特点，且能保证试验的重复性与稳定性。

从对不同加热方法和加热程度的偶蹄类肉、禽类食品的蛋白质变性情况的检测结果来看，加热方式对变性蛋白电泳图谱的影响不大，产品在加热过程中曾经达到的最高中心温度以及相应的维持时间是影响蛋白图谱条带的主要因素。随加工温度的增高，维持时间的增加 ，蛋白质的大分子量条带趋于消失，而在小分子量区域的条带不但不变，有时甚至有增多现象，这就提示了加热过程可使大分子可溶蛋白变性而减少。反言之，根据蛋白电泳图谱可提示肉、禽产品是否经过适当有效的加热处理，验证加热效果。

 

全自动蛋白芯片检测法做为热加工肉及含肉制品HACCP体系验证措施的前景和展望

上述讨论结果给我们带来了通过全自动蛋白芯片检测法来验证热加工肉类产品是否达到法规要求的加热程度的全新视点。我们可以这样做：将成品样品分成两份，一份直接按照上述方法步骤进行检测，得出图谱（如下图3）；将另一份进行水浴或蒸等加热处理，但在这过程中须严格控制样品的加热程度不能超出法规临界要求，比如按日本农林水产省相关要求，使样品在中心温度达到70度开始维持并计时1分钟后中止加热，然后做电泳检测并得出另一张图谱（如下图4）。根据蛋白加热变性的不可逆性，加热充分的成品样品即使经过再次加热，其图谱的前后变化也不大，而加热不充分的成品样品经过再次加热后蛋白图谱会有较大的差异。通过两个图谱的对比判断，可判断样品所代表的成品是否达到了法规基本加热要求。但值得注意的是，样品按法规要求进行热处理时务必“见好就收”，即控制好中心温度和维持时间，以免得到超出实际法规加热限值的图谱而做出误判。

 

让我们把目光再次投向近年来的多起输日热加工禽肉、偶蹄类肉产品的加热不充分事件：日本农林水产省对从中国大陆进口热加工含偶蹄类肉、禽肉类产品的动物卫生要求中明确规定了几种不同加热方式的加热要求，并据此开展贸易产品的验证性检测，“加热不充分”事件的判定也就是基于样品热处理前后的蛋白电泳图谱比对；不过据了解，他们尚未采取全自动蛋白芯片检测，因而试验结果的重复性和稳定性较差，况且法规加热限值图谱是否存在偏差也不得而知。相信如果我们在对日出口热加工禽肉、偶蹄类肉产品贸易中开展了一定规模的变性蛋白电泳检测来验证产品的加热效果，我们就会有足够的底气和数据与日本农林水产省等部门平等对话和交流，只有建立了蛋白变性图谱与不同加热程度的数据基础平台，才可以防止日本有关部门随意将稳定性、重复性有待质疑的蛋白质电泳检测结果作为判断产品是否满足其法规要求的单方面行为，同时也可以为我国进口同类产品设立科学、易行的技术壁垒手段。

因此，我们满怀信心：将全自动蛋白芯片检测验证产品法运用于热加工含肉食品HACCP实施中的产品加热效果验证势在必行，且有着非常实用的前景！

 

 

参 考 文 献

1. Experion™ 系统使用手册，伯乐生命科学有限公司

2. JIS 3837-1995, SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析通则

3. 刘恒等，生猪肉与加热猪肉SDS-PAGE电泳检测方法的研究，口岸卫生控制，第9卷第1期，14-15

4. 贺艳等，肉类加热重点温度检测方法的研究进展，Food&Machiney,2004(4),22-24

 

2007年6月