谢海锋[1] 励梅芬[2] 张彩珍[2]
1中国检验认证集团宁波有限公司 315012 2宁波出入境检验检疫局315012
摘 要：本文通过对3000克糖水葡萄罐头（去皮去籽）葡萄组织软化现象和少量糊化的原因进行研究分析，提出了良好的前提方案和合理的生产工艺流程是确保CCP监控有效性的重要因素，也为葡萄罐头生产企业确定杀菌温度时间、改进流程提供有效的理论依据和措施。
关键词：前提方案 工艺流程 CCP监控
前 言：糖水葡萄罐头所含的营养成分基本上与新鲜葡萄相同，一般含糖、维生素、无机盐、无机酸等成分，酸甜可口，深受消费者喜爱。然而，近几年出口的3000克糖水葡萄罐头（去皮去籽）由于罐头内容物组织软化和少量糊化现象，经常遭进口国退货或产品无法出口。通过对某罐头厂在2004年生产的一批3000克糖水葡萄罐头（去皮去籽），由于葡萄组织偏软和少量糊化使整批罐头无法出口的产品进行了分析研究，发现罐内组织软化是由微生物引起，并且在该批产品中分离得到了4株真菌，经中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种鉴定，确定为海枣曲霉（Aspergillus Ph oenicis）1株、萨氏曲霉（Aspergillus sydowii）2株、弗比恩毕赤酵母（Pichia fabianii）1株。对这4株真菌进行了耐热试验，发现这些菌株均有一定的耐热性，证明该产品是由于生产工艺中的杀菌温度不足造成的葡萄组织软化，找出了杀菌温度时间的确定与生产工艺流程的设置与食品安全体系的前提方案有着紧密的联系。目前，上述研究未见报道。
通过检出真菌并研究其耐热性，揭示了与文献中阐述的真菌菌丝及酵母菌对热的耐受力与不产生芽孢的细菌相同，在60℃中10min既被杀死而酵母与霉菌的孢子耐热性较菌体高出5-10℃【3】不符合，为3000克糖水葡萄罐头（去皮去籽）的杀菌温度的确定提供有效的理论依据，阐明了良好的前提方案和合理的生产工艺流程是确保CCP监控有效性的重要因素。
1材料与方法
1.1原料：
3000g/罐的同一批去皮去籽葡萄罐头共25罐，由浙江宁波某罐头厂提供。
1.2培养基与试剂
孟加拉红琼脂、营养琼脂、营养肉汤、酸性肉汤、麦芽浸膏肉汤等由北京陆
桥技术有限责任公司提供。
1.3微生物分离及感观检查
第一次分离：将储存期为60d的葡萄罐头1罐，以无菌操作开罐，取葡萄汤
汁经100℃15min加热处理，待冷却后每平皿吸取1ml葡萄汤汁倾注15ml营养琼脂，共接种4个平皿，分2组，分别37℃、55℃培养5-7d分离耐热芽孢菌并做感观检验。
第二次分离：将储存期为100d的葡萄罐头6罐，以无菌操作开启，各吸取葡萄汁1ml分别接种在营养肉汤、虎红琼脂平皿中，各做2个重复，27℃+-1℃培养7-15d后将营养肉汤中生长出的菌接种于虎红琼脂平皿中，做进一步分离纯化并做感观检验。
第三次分离：将储存期为180d的葡萄罐头18罐，以无菌操作开启，各吸取葡萄汁1ml分别接种在营养肉汤、麦芽浸膏肉汤、酸性肉汤中，虎红琼脂、营养琼脂中，每罐每种培养基均做2个重复，分别置于37℃和27℃±1℃培养7-15d并做感观检验。
1.4镜检
第一、二次送检样品分别做革兰氏染色镜检，第三次送检样品分别做革兰氏染色和活菌悬滴（压片）镜检。
1.5菌种鉴定
由中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种鉴定。
1.6耐热试验
从第一次、第二次送检样品中分离得到的3株霉菌分别接种于虎红琼脂、营养琼脂中，每株菌接4个平皿，27℃±1℃培养45d待平板上长出孢子后做耐热试验，用葡萄罐头的糖水100ml洗下2个平板的霉菌，每株菌各制成2个重复悬液进行耐热试验；并把第一次检样中分离到的1株霉菌用上述27℃±1℃培养45d的长菌平皿直接放入高压灭菌锅进行耐热试验，再进行直接培养与分离。第三次送检样品中发现的菌落块用营养肉汤培养后转营养琼脂斜面培养9D的菌，用葡萄糖水洗下后做耐热试验并用不接菌的葡萄罐头的糖水做空白对照。加热处理后的悬液分别接种到营养琼脂、虎红琼脂中，5-7d培养观察结果。
2.结果与讨论
2.1微生物的检出
三次送检的样品罐头糖水葡萄汤汁稍混浊，但属正常范围，PH值、葡萄的外观、色泽、气味均属正常，组织结构状态稍偏软。但在第三次送检罐头中第7罐发现一块白色菌落块，直径1.5cm左右，平坦的漂浮在汤汁中，罐头汤汁稍混浊在汤汁中有少量葡萄碎屑。组织与其它罐相比更软些，但葡萄粒还是整颗。3次打开的罐头，葡萄汤汁的糖度均为20.3%左右，PH值均在3.69-3.72之间。
三次送检的样品每罐汤汁采用直接涂片革兰氏染色镜检均为阴性。但在第三次送检样品每罐同时做活菌悬滴（压片）镜检，在第3、7罐经活菌悬滴压片不染色直接镜检，发现罐内有极少孢子和短节菌丝体。可见在同罐头中不同的制片方法，镜检观察得到的结果不同，究其原因葡萄罐头汤汁的糖度高达20.3%左右，挑取的汤水在干燥固定后形成厚厚的一层糖浆，革兰氏染色过程易被水冲洗掉，即使罐内有菌也不易被染上，从而影响观察结果。从白色菌落花流水块中切割一点做活菌悬滴压片镜检发现繁茂的菌丝体，菌落块符合丝状真菌的生长过程中产生繁茂的分枝而构成真菌的菌落【4】。而且菌丝枝节的生长总是向前或朝向菌落边缘这是真菌生长规律。
在第一次检测的葡萄罐头经100℃15min加热处理后经37℃和55℃培养5-7天，放37℃培养的2个营养琼脂平皿中均有霉菌生长，并不是芽孢菌。而55℃培养的2个营养琼脂平皿中无任何微生物生长。而且发现每ml葡萄罐头的糖水中约有霉菌12个左右，均匀地颁生长在营养琼脂平皿中间用L-1表示，与罐内条件吻合。而且在37°C培养5天后生长而在55°C培养下却不生长，又喜欢偏酸性的环境，这些都符合霉菌的微生物学特性。
在第二次检测的6个葡萄罐头，分别做霉菌检测，在孟加拉红琼脂平皿中无任何菌，但在第1、4、5罐的营养肉汤中有菌生长，将营养肉汤中生长出的菌转接孟加拉红琼脂中，根据菌落形态特征确定为霉菌，其中1号2支菌株相同，4号、5号菌株相同，分别用L-2，L-3表示。
第三次送检的18罐罐头，取其糖水葡萄汤汁每罐分别接种于营养肉汤等五种培养基中，分别37℃和26℃±1℃培养7-15d后，未见任何微生物生长。而在第7罐中发现一块白色的真菌块将其切割小块，分别接种于虎红琼脂和营养肉汤，分别放37℃和27℃培养，在虎红琼脂平皿中不见生长，而在营养肉汤中15d后检出孢子，20d后可见芽管长出短菌丝。该菌用L-4表示，白色的菌块经培养后长出菌丝体，说明菌落块在适宜生长的环境能复活，罐头中的菌落块完整的漂浮在罐头汤汁中，说明不是带进去的而是罐内自身繁殖形成，这就表明了罐头中有真菌存在，从三次接种培养来看，随着在罐内生长的时间延长，接种罐数增长，长菌率反而降低说明到了一定的罐藏时间，由于氧气的耗尽使真菌处于致死或休眠状态。经中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种鉴定确定：L-1为海枣曲霉（Aspergillus Ph oenicis）、L-2、L-3为萨氏曲霉（Aspergillus sydowii）、L-4为弗比恩毕赤酵母（Pichia fabianii）
2.2真菌的耐热性
经100℃耐热试验后把L-1、L-2、L-3、L-4的4株菌悬液按耐热试验时间不同，分别转接营养琼脂、虎红琼脂培养基中，并同时与耐热试验后菌悬液一起放37℃、27℃经5-7d培养观察结果。发现L-1、L-2、L-3均能耐受100℃25min热处理。而在116℃20min耐热试验后的菌悬液经接种培养后均不能存活。由于L-1菌在100℃所做的耐热试验时间中全部生长，故把该菌用45d培养后的真菌平皿直接放在高压灭菌锅116℃20min耐热试验，然后把耐热处理过的L-1真菌平皿继续培养27℃10d后，转接营养琼脂斜面和营养肉汤发现该菌仍然存活，可见相同温度、相同时间、相同菌株，不同耐热的环境菌的耐热性不同，在琼脂平皿上生长的真菌由于是不直接接触液面耐热性强。
2.3内容物组织软化原因分析
综上所述罐内少量真菌利用糖水葡萄中的多糖，在有糖源程序环境中能自身缓慢生长，在繁殖过程中它可以分解果肉组织中的果胶物质，降解果胶的多糖链使葡萄组织软化，与资料所述酵母菌和霉菌都会引起食物不同程度分解和腐败【6】相吻合。而罐内真菌在缺氧（罐内有3mm顶隙）或无氧条件下只能利用已糖作为碳源，氨基酸作为氮源利用自身储存的营养物作为呼吸作用的底物，因为至今没有找到专性厌氧的真菌所以繁殖到一定程度后氧气耗尽，开始处于致死或休眠状态。因此罐内真菌由于环境因素只能轻微分解使葡萄组织软化，未达到腐败期即使进入休眠或死亡期，少量葡萄组织糊化是由于污染严重，罐内含菌量高。
2.4工艺流程的改进
从葡萄组织软化、葡萄罐内真菌检出、真菌的耐热性等综合分析，说明， 25min/88-90℃，中心温度达到79℃±0.5℃不足以彻底杀灭用传统的葡萄罐头生产工艺流程生产出来的产品。但如果提高杀菌温度和时间，会造成葡萄罐头的组织偏软、影响口味、降低营养。为了达到既能保证杀菌效果，又能满足组织、口味不受影响，我们只有在生产工艺流程上下功夫。
通常含菌量对灭菌效果有很大影响，因此防止生产过程菌的交叉污染，控制生产过程中的菌量，对杀菌温度时间的确定有极大的关系。传统的生产工艺流程是：原料验收 →清洗消毒→剪枝选果（包括去烂果）→漂烫冷却→去皮去籽→ 灯检 → 挑选分级→淘洗 →沥水→装罐称重→热烫→加汤→封口→杀菌冷却→揩听入库 。这里可以看到，传统的生产工艺流程由于原料验收后未进行挑选，直接清洗导致烂果在清洗时真菌扩散，造成交叉污染，影响了最后的杀菌效果。所以，改进工艺流程线路把清洗消毒与剪枝选果进行交换，使霉烂果在清洗消毒前去除，防止真菌扩散。生产工厂可以在原料验收后首先剪枝选果，把原料剪成4-8小枝，同时去除霉黑点、伤烂、病虫害、破裂果等，然后把剪枝后的果实先淋2-3min,再用0.05%高锰酸钾液浸5min，这样可控制菌量在生产过程中扩散和交叉污染，保持原料和半成品的新鲜度，确保杀菌工序的杀菌效果。
总之，糖水葡萄罐头因采用低温连续杀菌，故必须采用食品安全管理体系，严格科学地做好工艺流程中的卫生和消毒工作，控制生产过程中的菌量，把罐头微生物的安全性把关在杀菌前，有效保证产品质量。
同样在425g糖水桔子罐头中分离出真菌和酵母菌。
3.结论：
⑴本实验在密封性、感官、PH正常的葡萄罐内检出了4株真菌，找到了使葡萄组织软化的真正原因。其中萨氏曲霉（聚多曲霉）有文献报道，能引起阻塞性支气管曲霉病，也可以引起耳道曲霉病。研究其耐热性，发现真菌的耐热性超过文献资料的理论和生产工艺中规定的杀菌耐热温度，为生产工艺流程线路的改变、杀菌温度时间的确定提供了有价值的参考数据及理论依据。
⑵良好的食品安全体系的前提方案、合理的生产工艺流程是确保关键控制点监控有效性，确保食品安全的重要因素。
⑶审核员在食品安全体系认证现场，在重点关注HACCP计划和关键控制点时，也应该关注生产工艺流程设置的合理性，系统地评价食品加工企业建立的食品安全管理体系的有效性、合理性。
⑷食品加工企业的生产工艺多种多样，审核员不但应具备食品安全体系的审核技术，更应具备食品生产专业的理论和实践知识、法律法规等知识。
参考文献
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《良好的前提方案和合理的生产工艺流程是确保CCP监控有效性的重要因素》
