张宁1,2，林洪1*， 隋涛2，钟响2，张艺兵3
(1.中国海洋大学水生生物制品安全性实验室，青岛 266003；2. 烟台检验检疫局，烟台 264000；3. 山东出入境检验检疫局，青岛 266001)
摘要：牡蛎是我国出口量较大的水产品之一，由于产品本身的特殊性，在生长过程中易产生腹泻性贝毒（DSP）。本实验中原料牡蛎DSP生物法检测结果为阴性，冷冻贮存4个月后检测结果即为阳性。本研究以分析这一变化原因为目的，采用LC-MS法对DSP生物检测的阳性样品进行确认，结果表明，生物法DSP检测的结果为假阳性，造成生物法DSP检测中小白鼠死亡的是牡蛎在贮藏过程中产生的脂溶性有毒物质。通过进一步分析，最终确定该有毒物质的成分为牡蛎脂肪水解物-游离脂肪酸。同时本研究对牡蛎在不同贮存温度和贮存时间下产生的游离脂肪酸含量进行测定，在-10℃贮存温度下，贮存0、2、4、6、8、10个月，游离脂肪酸的变化范围为5.2-788.6 mg/kg；在-10℃，-18℃，-25℃贮存温度下，贮存4个月，游离脂肪酸的变化范围为389-92.5 mg/kg。
关键词：冷冻 牡蛎 贮存 游离脂肪酸 有毒物质
中图分类号：S984.3 文献标识码：A
Research on Fat-soluble Toxicant in Stored Frozen Oyster
（Zhang Ning1,2, Lin Hong1, Sui Tao2, Zhong Xiang2, Zhang Yi Bing3）
(1.Seafood Safety Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003; 2.Yantai Inspection And Quarantine Bureau,Yantai,264000; 3.Shangdong Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau, Qingdao 2660010)
Abstrats: Oyster is the larger exports of aquatic products in our country. Due to the specificity of the products, diarrhetic shellfish poisoning (DSP) was easy to enrich in the growth process. In this experiment, DSP biological test results are negative in raw oysters, but positive when it was in frozen storage for four months. The purpose of our research was to analysis this change. LC-MS method was used for biological detection of DSP-positive samples. It confirmed that DSP biological detection was false-positive results, which led to mice died in biological detection of DSP was the fat-soluble toxic substances produced in the process of oysters frozen storage. Through further analysis, the toxic substances was the hydrolyzate of oyster fat -free fatty acids(FFA).At the same time, FFA of oyster were determined at different storage temperature and storage time. FFA changed in the range of 5.2-788.6mg/kg for stored 0,2,4,6,8,10 months at -10℃; FFA changed in the range of 389-92.5 mg / kg for stored 4 months at -10℃, -18℃, -25℃.
Keywords: frozen; oyster; storage; free fatty acids；toxicant
______________________________________________________________________________
作者简介：张宁（1970-11）女, 山东烟台人, E-mail:ytciqzn@tom.com
通讯作者：张宁，Tel:13605356802
2004年以来，我国出口日本的冷冻牡蛎产品不断地被日方通报检出腹泻性贝毒(DSP)。通过调研了解到，被日本通报的牡蛎产品均为冷冻裹面包粉牡蛎。带壳原料牡蛎收获季节为11月份至第二年的4月份，由于日本裹粉牡蛎大多在春季末形成消费高峰，因此带壳牡蛎须经去壳冷冻成为半成品后进行冷藏备用，加工前进行贝毒检测。由于贝毒在产品的加工、贮存过程中不会有变化，因此加工企业在出口时通常不再进行贝毒检测。通过调研发现，被日本通报的牡蛎产品在收购原料或半成品时都进行了贝毒检测，合格后再进行加工，正常情况下成品不应该出现贝毒阳性的情况。为此，本文对牡蛎产品贝毒检测阳性的原因进行调查研究，并对其进行进一步分析、控制，以期探讨牡蛎产生有毒物质的原因。
1 材料与方法
1.1 实验材料与设备
新鲜牡蛎，去壳后于冷藏库冷冻，鲐鱼、马哈鱼，脂肪酸标准品：C12:0，C14:0，C16:0，C16:1，C18:0，C18:1, C18:2，C20:5，C22:4，C22:6（Sigma），氢氧化钠，丙酮，硫酸，乙醚，吐温-60（均为化学纯），正己烷（色谱纯），甲醇（色谱纯），
GC6890N气相色谱仪（Agilent），配FID检测器，INNOWAX石英毛细管柱，检测条件：检测器温度：250℃，柱温：初温80℃，以15℃/min升至230℃，保持14min，载气：氮气，流量：1.5mL/min，尾吹气流量：40mL/min，空气流量：450mL/min，氢气流量：40mL/min；旋转蒸发器；均质器；注射器；
昆明系雄性小白鼠（体重16-20g）。
1.2实验方法
1.2.1牡蛎中脂溶性物质的提取方法
取200g均匀样品放入均质杯，加入3倍量丙酮均质2min。用布氏漏斗抽滤并收集滤液。对残渣以检样两倍量再抽滤两次，合并抽滤液。对抽滤液减压浓缩去除丙酮。用100mL乙醚和20ml的水洗浓缩物，轻轻震荡，静置分层后去除水层,定容至200mL。
1.2.2 游离脂肪酸（FFA）的测定
1.2.2.1 Amberlyst-26(A-26)阴离子交换树脂的处理：
称取5g A-26树脂加入50mL 0.5mol/L的NaOH溶液，振摇30min后倾去NaOH液，依次用去CO2蒸馏水和甲醇洗3次，每次振摇20min，重复处理一次后将A-26树脂保存于甲醇中。
1.2.2.2 游离脂肪酸的测定
取1.2.1中牡蛎中提取液2mL于具塞三角瓶中，加入15mL丙酮-甲醇（2：1）溶液，加入200mg树脂，以120r/min水平振摇30min，静置除去溶剂，用丙酮-甲醇溶液洗涤树脂5次（共15mL），室温下氮气吹干树脂并转移至干试管中，加入1mL1%硫酸、2mL甲醇，70水浴30min，充分冷却后加入2mL正己烷、1mL蒸馏水，振摇至两相清晰，取1µL正己烷层进行气谱分析
1.2.3牡蛎脂类提取液毒性研究
1.2.3.1脂肪提取液注射液制备
1.2.1提取液200mL，在茄形瓶减压浓缩去除乙醚，浓缩物以少量乙醚溶解后再次减压浓缩去除乙醚，所得浓缩物用1%吐温60生理盐水定溶至10mL。
1.2.3.2 SN0294-93 贝类腹泻性贝毒检验方法（生物法）
2 结果与分析
2.1 DSP阳性确认
对半成品牡蛎及贮藏5个月的牡蛎进行DSP测定。测定结果见表1。
表1 不同测定方法测定牡蛎中DSP
Table 1 The results of DSP by different methods
|
|
半成品牡蛎
|
贮藏5个月牡蛎
|
|
生物法
|
阴性
|
阳性
|
|
LC-MS
|
阴性
|
阴性
|
目前，用于DSP检测的方法主要有小鼠腹腔注射法（生物法）、酶联免疫法、细胞毒性测试法、HPLC以及LC-MS等方法。其中生物法和HPLC使用较多。在生物法中，由于DSP的提取过程复杂，易受杂质干扰，假阳性结果时有出现[1]。因此我们采用准确度较高的LC-MS 作为验证方法。
生物法进行DSP检测方法的主要原理是采用有机溶剂对待测样品进行萃取，经提纯浓缩后加入吐温溶解后进行小白鼠腹腔注射，根据小白鼠的死亡情况判定被检样品是否含有DSP。因此生物法DSP检测的实际上是脂溶性有毒物质。通过表1的结果，我们可以判定造成生物法DSP检测中小白鼠死亡的不是DSP，而是牡蛎在贮藏过程中产生的其他物质导致生物法DSP检测的假阳性。
为了进一步进行验证，我们又选取了含脂肪较多的鲐鱼、马哈鱼进行验证。
取冷冻一个月及经过两年冷冻贮存的鲐鱼、马哈鱼，按生物法DSP检测方法进行检测，结果表明经过长时间贮存的水产品也能造成小鼠死亡（表2）。由于鱼类本身不可能含有DSP，因此判定DSP结果实际为假阳性。
冷冻造成牡蛎组织结构不同程度上的破坏，这些变化以不同的方式影响组织内酶的活性，造成冷冻产品成分发生改变[2]。陈慧斌[3]等人的实验结果也证明，去壳牡蛎容易遭受微生物的侵染，而微生物的作用加剧了牡蛎脂肪的变化。
表2 不同种类的水产品DSP检测结果（以小白鼠死亡与否衡量）
Table 2 The DSP results of different seafood
|
贮存时间
|
鲐鱼
|
马哈鱼
|
|
一个月
|
不死亡
|
不死亡
|
|
两年
|
死亡
|
死亡
|
牡蛎中存在较多的脂肪，这部分脂肪在贮存过程中可能发生水解和氧化反应，产生游离脂肪酸及进一步的氧化产物，最终可导致牡蛎严重酸败（油烧）失去食用价值[4]。在随后对游离脂肪酸毒性研究中发现，游离脂肪酸对小白鼠进行腹腔注射时表现的毒性远远高于对其进行口服时的毒性。徐正婕等人[5]也提出游离脂肪酸能够造成动物的肝损伤，导致试验动物的肝细胞凋亡和肝纤维化。因此，牡蛎中脂肪最初分解的产物游离脂肪酸就会对小白鼠产生较强的毒性，即贮存的牡蛎半成品在产生明显酸败前已表现为生物法DSP检测结果的阳性。
2.2 游离脂肪酸的测定结果
图1为多种游离脂肪酸混合标准图谱，图2为原料牡蛎脂肪酸图谱, 图3为 -18℃牡蛎贮存六个月后游离脂肪酸图谱。Toru Takagi[6]就纯游离脂肪酸的毒性进行了调查，结果发现不同种类的脂肪酸其毒性差异很大, C20:4 n-6、C18:3 n-3、C20:5 n-3表现出高毒性，C18:2 n-6、C18:4 n-3、C22:6 n-3表现出低毒性，C18:1 n-9表现出弱毒性，在贝类中主要的有毒游离脂肪酸为EPA(C20:5n-3)。本实验通过比较研究发现，牡蛎在不同贮存条件下产生的各种游离脂肪酸的比例大致相同，我们选取C20:5作为游离脂肪酸代表性检测指标（下同）。
2.2.1同一温度不同贮存时间游离脂肪酸的测定结果
在-10℃贮存条件下，取0个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月的样品进行游离脂肪酸检测，测定结果见表4。
2.2.2不同温度同一贮存时间游离脂肪酸的测定结果
在-10℃、-18℃、-25℃条件下贮存四个月，进行游离脂肪酸检测，测定结果见表5。
对实验结果进行分析，牡蛎贮存过程中游离脂肪酸变化情况为：在贮存温度相同的条件下，牡蛎中游离脂肪酸含量随贮存时间的增加而升高（表4）；在相同贮存时间中，牡蛎中游离脂肪酸含量随贮存温度的升高而升高（表5）。
图1 游离脂肪酸混合标准图谱
Fig.1 Chromatogram of standard FFA
图2 原料牡蛎中游离脂肪酸图谱
Fig.2 Chromatogram of FFA in raw oyster
图3 -18℃牡蛎贮存六个月后游离脂肪酸图谱
Fig.3 Chromatogram of oyster FFA for 6 months at -18℃
表4 不同贮存时间下牡蛎FFA(C20:5 n-3)含量
Table4 The content of FFA in Oyster at different reserved time
|
贮存温度
|
贮存时间
|
游离脂肪酸含量(mg/kg)
(C20:5 n-3)
|
|
-10℃
|
0个月
|
5.2
|
|
-10℃
|
2个月
|
257.9
|
|
-10℃
|
4个月
|
389.0
|
|
-10℃
|
6个月
|
506.5
|
|
-10℃
|
8个月
|
645.3
|
|
-10℃
|
10个月
|
788.6
|
表5不同贮存温度下牡蛎FFA含量
Table5 The content of FFA in Oyster at different reserved temperature
|
贮存温度
|
贮存时间
|
游离脂肪酸含量(mg/kg)
(C20:5 n-3)
|
|
-10℃
|
4个月
|
389
|
|
-18℃
|
4个月
|
238.4
|
|
-25℃
|
4个月
|
92.5
|
2.3牡蛎脂类提取液毒性测定结果
表6为-10℃下5个不同贮存时间的牡蛎脂肪提取液对小鼠进行腹腔注射时的平均致死时间。从结果可看到，牡蛎贮存时间越长，小鼠腹腔注射的平均致死时间越短，说明其提取液的毒力越强。
表6不同贮存时间小鼠的平均致死时间(-10℃)
Table.6 The average terminal time of rats at different reserved time(-10℃)
|
贮存时间
|
平均致死时间（h）
|
|
0个月
|
未死亡
|
|
2个月
|
24
|
|
4个月
|
20
|
|
6个月
|
15
|
|
8个月
|
12
|
3 讨论
新鲜牡蛎干粉中脂肪的质量分数约为 l1.5％，脂肪中含有丰富的n-3多不饱和脂肪酸，特别是 DHA与 EPA约占脂肪酸总量的25%[7]。牡蛎在贮藏期间脂肪主要发生氧化和水解两种形式的变化[8]。对于本实验研究的牡蛎产品，由于其在贮存过程中有塑料袋密封冷冻保存，属于相对缺氧的环境，因此本实验牡蛎脂肪在贮存条件下发生的主要是水解变化，产物主要为游离脂肪酸。目前生产企业、检验检疫部门等进行DSP检测时一般采用生物法，即检测牡蛎产品中的脂溶性有毒物质。游离脂肪酸经腹腔给小白鼠注射后会导致小鼠死亡，从而导致生物法检测牡蛎中DSP时产生假阳性。
此外游离脂肪酸对小白鼠检测结果有很大影响，其影响大小不单与量的多少有关，其组成的不同，结果差异也很大。体外细胞培养证实，富含多不饱和脂肪酸的乳糜微粒对单核细胞和内皮细胞的毒性最强，而富含单不饱和及饱和脂肪酸的乳糜微粒几乎无或很少有毒性[9]。富含油酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸的玉米油、鱼油可促进酒精、四氯化碳引起的大鼠肝损伤，而富含棕榈酸等饱和脂肪酸的棕榈油则可逆转酒精所致肝损伤[10,11]。其原因为不饱和脂肪酸可激活肝内脂质过氧化反应，且其常优于饱和脂肪酸合成磷脂和TG，从而改变肝内蓄积TG的组成及其对氧应激脂质过氧化损伤的敏感性。而饱和脂肪酸则可减少环氧合酶及TNFα的含量，抗脂质过氧化，并抑制肝组织对不饱和脂肪酸的摄取。实验中牡蛎样品1g中仅有几毫克的游离脂肪酸也可显出毒性，但其最终的毒性与过氧化物的影响有复杂的联系，目前还没有实际的关于贝类的特定指标与小白鼠实验毒性之间相关的报告。
参考文献：
[1] 李爱峰,于仁成,李钧等. 用蛋白磷酸酶活力抑制法检测牡蛎体内的腹泻性贝毒. 分析化学.2006,34: 283-287
[2] 叶盛权,郑贤德. 冷冻对牡蛎品质的影响. 食品研究与开发.2003, 24(l):73-75
[3] 陈慧斌, 王梅英, 王则金, 陈丽娇. 牡蛎冻藏期间脂肪氧化影响因素研究. 西南大学学报(自然科学版). 2008,30(8):96-101
[4] 劳邦盛, 盛国英, 傅家谟等. 牡蛎中脂肪酸在储藏过程中的稳定性.色谱. 2000, 18(4) : 340-342
[5] 徐正婕，范建高，王国良.游离脂肪酸在脂肪性肝炎发病中的作用[J].中华肝脏病杂志.2000，8（2）：127-128
[6] Toru Takagi,Yutaka Itabashi. Occurrence of mixtures of geometrical isomers of conjugated tadecatrienoic acids in some seed oils: Analysis by open-tubular gas liquid chromatography and high performance liquid chromatography .Lipids,1981, 16(7)
[7] 汪何雅,杨瑞金,王璋．牡蛎的营养成分及蛋白质的酶法水解[J]．水产学报，2003，27(2)：163-168
[8] 陈慧斌,王梅英,王则金．牡蛎贮藏品质变化及保鲜技术研究进展[J]．河南科技大学学报(自然科学版)，2006，27(3)：71-75
[9] Mabile L Salvayre R, Bonnage MJ,et al. Oxidizablity and subsequent cytotoxicity of chylonlicrons to monocytic U937 and endothelial cells are dependent on dietary fatty acid composition. Free Radic Biol Med ,1995,19:599-607
[10] Galli A, Price D,Crabb D. High-level expression of rat class I alcohol dehydrogenase id sufficient for ethanol-in-duced fat accumulation in tranduced HeIa cells. Hepatology,1999,29:1164-1170
[11] ZeiseI SH da Costa KA . Albright CD,et al. Choline and hepatccarinogenesis in the rat . Adv Exp Med Biol. 1995,375:65-74
《冷冻牡蛎贮存过程中脂溶性有毒物质的变化研究》.doc