二、原理
三、双层平板法的应用1-噬菌体的分离培养
1.试验详细操作步骤
(1)配制底层培养基和上层培养基
底层培养基琼脂粉含量:1.5%-2%。
底层培养基培养基:无菌水加1.5%-2%琼脂粉,灭菌,待冷却至50℃倒平板,凝固后备用。
上层培养基琼脂粉含量:1%。
(2)倾倒上层培养基
一般情况,待测样品为噬菌体污染的样品。
①取培养基:取出上层培养基,冷却至45℃左右。
②取样品:用移液器取样品0.5mL放入上层培养基中。
③取试验菌:接着用移液器吸取大肠杆菌菌液0.2mL,也放入上层培养基中,沿壁摇匀。
④倾倒平板:将上述混合液快速倒入底层培养基上面,凝固。
(3)培养
上层培养基凝固后,放置于恒温培养箱中倒置培养。
2.操作技巧:
(1)底层培养基不宜太厚,覆盖培养皿底部即可。
太厚上层培养基无法倒入,太薄不能覆盖培养皿底部,起不到应有的作用。
(2)上层培养基灭菌完成后,要摇匀放入水浴锅中,间隔沿壁摇动。
经常摇动,培养基不容易出现结块。
(3)水浴锅温度调至60℃,温度不宜太高或太低。
温度太高,想用的时候冷却较慢;温度太低,凝固的又太快。
(4)上层培养基温度降至45℃左右,再加入污染菌液和试验菌。
这个温度既能保证培养基和菌液混匀,又能保证不凝固不结块。
(5)上层培养基要沿壁摇匀,尽量避免产生气泡。
气泡太多,噬菌斑锯齿状,很难看。
(6)控制好试验菌浓度。一般正好覆盖一层菌液为好。
3.注意事项:
(1)酒精灯旁边操作,时刻保持无菌意识。
(2)双层平板法相对厚度不易把握,一定要看准,不能溢出或太厚。
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