二、原理

三、双层平板法的应用1-噬菌体的分离培养

1.试验详细操作步骤

(1)配制底层培养基和上层培养基

底层培养基琼脂粉含量：1.5%-2%。

底层培养基培养基：无菌水加1.5%-2%琼脂粉，灭菌，待冷却至50℃倒平板，凝固后备用。

上层培养基琼脂粉含量：1%。

(2)倾倒上层培养基

一般情况，待测样品为噬菌体污染的样品。

①取培养基：取出上层培养基，冷却至45℃左右。

②取样品：用移液器取样品0.5mL放入上层培养基中。

③取试验菌：接着用移液器吸取大肠杆菌菌液0.2mL，也放入上层培养基中，沿壁摇匀。

④倾倒平板：将上述混合液快速倒入底层培养基上面，凝固。

(3)培养

上层培养基凝固后，放置于恒温培养箱中倒置培养。

2.操作技巧：

(1)底层培养基不宜太厚，覆盖培养皿底部即可。

太厚上层培养基无法倒入，太薄不能覆盖培养皿底部，起不到应有的作用。

(2)上层培养基灭菌完成后，要摇匀放入水浴锅中，间隔沿壁摇动。

经常摇动，培养基不容易出现结块。

(3)水浴锅温度调至60℃，温度不宜太高或太低。

温度太高，想用的时候冷却较慢；温度太低，凝固的又太快。

(4)上层培养基温度降至45℃左右，再加入污染菌液和试验菌。

这个温度既能保证培养基和菌液混匀，又能保证不凝固不结块。

(5)上层培养基要沿壁摇匀，尽量避免产生气泡。

气泡太多，噬菌斑锯齿状，很难看。

(6)控制好试验菌浓度。一般正好覆盖一层菌液为好。

3.注意事项：

(1)酒精灯旁边操作，时刻保持无菌意识。

(2)双层平板法相对厚度不易把握，一定要看准，不能溢出或太厚。