答：保存的是第三代复活出来后，如果采用平板或肉汤活化相当于转接了一代，就是第四代了，如果还在瓷珠里的话就还是原来的代数。如果是保存在斜面上，这一支斜面一直就是第三代，如果转接到另一支斜面就是第四代了。传代原则，菌株活化复苏不论以任何形式繁殖了一次就算是传了一代。但如果仅是物理位置的转移没有繁殖就不是传代，需要注意。

2.刚买回来的阳性菌株是第0代吗？

答：一般菌株你买回来的时候上面都会写明第几代，常规来说都是第0代的。像购买的ATCC或CICC的冻干粉都是标记为0代的。

3.菌株传代保存到瓷珠里一定要挑单菌落吗？

答：不一定非挑单菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是说从同一个菌落纯化出来的，以保证它们的特性完全一致。原则是尽量多挑，宁多勿少。

4.菌株保存是-70℃还是-80℃有具体标准规定么？

答：其实是有标准的，《SN/T 2632-2010 微生物菌株常规保藏技术规程》是关于菌株保藏的一个标准，大家可以学习一下，各个保存方式都有介绍，但是瓷珠是比较新兴的保存方式暂时里面还没有收录。

5.怎样延长菌株的保存时间呢？

大量的实验证明菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。

6.怎样纯化菌株？

纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转接一次，这就相当于纯化了。

7. 我们保存的一代菌株是不是要重新传代保存呢，认证老师会不会认为这是个错误？

答：应该不会，认证老师不会提出这种问题的，不过最好是一代菌株保存一些、二代菌株保存一些，使用时工作菌株最好使用第三代菌株，一代菌株可作为长期保存用。

8. 为何要将第三代作为工作菌株？

答：多传代几次后菌株的活力会明显提高，但最多传代到第五代后就不能用了，因为第五代后菌株虽然不会完全变异，但变异率会明显增加，因此选用第三代作为工作菌株是比较合适的，若使用第一、第二代菌株活力没有那么强。

9.用瓷珠管反复上下摇匀，有泡沫不容易吸出来，怎么办？

答：不必特别剧烈大尺度的摇动瓷珠管，稍微上下晃动就可以；如果确实有泡沫的话可以静置一会，让菌株多吸附一下瓷珠也是可以的。

10. 老师，霉菌需要长出孢子保存，可有霉菌孢子的图片，长到什么程度就可以保存了呢？

保存这种黑色孢子就可以，这是黑曲霉的图片。

11. 瓷珠管液体混匀可以吹吸么？

答：不建议吹吸，因为空气里可能也带有部分的细菌，万一使用的枪头等有菌混进去就不太好了，直接拧紧保存管盖子后上下摇晃即可。

12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里吗？

答：2-8℃保存，放在冷藏是可以的；注意弧菌和绿脓杆菌要放到室温20-25℃保存，否则会很快死亡。

13.如果TSA斜面放在冷冻里面，会有什么影响？

答：琼脂冷冻后性状会发生改变，会变得很软，结构发生改变，所以不建议冷冻；如果要冷冻的话就采用甘油保存法或瓷珠保存法。

14.用瓷珠管保存产气荚膜梭菌老是保存不好！做好瓷珠管之后瓷珠管要放到厌氧袋里面再放到-20℃么？

答：如果冷冻保存最好放在厌氧袋里再-20°保存，保存效果还可以；或者可以采用庖肉培养基保存，它是一种液体培养基，将产气荚膜梭菌接进去然后2-8 ℃保存，可以保存一年没有问题，在厌氧环境下保存效果最好。