GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定

 

一、称样：

（1）一般称量25g，由于称样量较大，标准中对于称样的准确性未作出明确规定，微生物室常用称样的电子天平最大允许误差为±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原则，即实际称样时可根据样品情况称取超出25g（如硬质糖果等，检验人员应依据样品实际情况决定如何称样）；

 

（2）对于部分食品添加剂已明确须称取1.0g的，则须严格精确称量。

 

二、样品稀释：

（1）固体或半固体：称取25g样品于均质袋中，加入已灭菌的生理盐水225g，稍捏碎（特别是糕点/面包及其他淀粉制品），放入拍击式均质器均质1min，此时即制备成1：10的样品匀液。以移液器或灭菌吸取该液体至9mL灭菌生理盐水试管中，换上新的灭菌移液器枪头，缓缓吸取液体后反复吹打2次，此时即制备成1：100的匀液，以此类推，制备10倍系列稀释匀液。

 

（2）液体样品：直接吸取原液进行检验，稀释时可直接吸取1mL原液到9mL灭菌生理盐水试管中按照“固体或半固体”的方式稀释。

 

三、稀释度的选取：

液体样品可直接取原液进行检验；固体或半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1：10，1：100，1：1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：100000甚至1：1000000）。

 

四、质量控制：

空白对照：分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照。（若空白有菌落生长则该实验无效）。

 

五、平板计数琼脂（PCA）：

灭菌条件为121℃、15min。一般情况下于500mL敞口锥形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

 

六、有时样品基质比较特殊，样品匀液有细小的颗粒与菌落不易区分，此时可采用如下方法进行区分：

 

（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又称红四唑或红四氮唑，简称TTC），高压灭菌后避光冷藏备用。红四唑灭菌条件为：121℃、20min；

 

（2）待PCA琼脂培养基冷却至适宜倾注温度时，无菌加入上述TTC溶液2mL，充分摇匀（此时PCA中TTC浓度为0.005%）。

 

加入TTC的目的及注意事项：培养后，菌落被TTC染成红色，而样品颗粒不变色，方便计数；PCA中TTC的浓度不宜过高，否则会抑制微生物的生长，对实验结果产生影响。（特殊情况下方添加TTC，常规实验无须添加，特别是对于菌落数量较少的样品不宜添加。方法来源依据为《化妆品卫生规范》中菌落总数测定相关章节）

 

七、稀释液：

常采用0.85%氯化钠溶液（生理盐水），121℃、15min高压灭菌后冷却备用。

 

八、倾注培养基时，根据对样品污染情况的估计（同一类型样品的微生物检测经验），若样品有表面蔓延生长的可能性，则待第一次倾注的琼脂凝固后，可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。

 

九、水产品30±1℃培养72±3h；其它样品36±1℃培养48±2h。注意：此处的“水产品”是指生鱼片、鱿鱼干等未经深度加工的水产品。

 

十、本标准的重难点为菌落计数及计算。

 

除标准中已说明的要求外，有以下几点需要注意：

（1）菌落计数时，从低稀释度的平板开始计数。若所有平板上的菌落数均小于30CFU，则须计数所有平板上的菌落数，但仅采用最接近30CFU的两个平板的菌落数来计算最终菌落总数。

以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

  

（2）当第一稀释梯度一个板上菌落数高于30，另一个低于30，则依据标准应当以介于30-300之间的菌落数作为该稀释梯度的菌落数。（存在争议，实际遇到该类情况时应谨慎对待）

以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

（3）若所有平板上的菌落数均大于30CFU，则只计数30-300CFU之间的平板上的菌落数，并采用这些数据，依据标准中给定的公式，进行最终菌落总数的计算，此时将大于300CFU的记为“多不可计”，以“TNTC”表示。

以固体样品举例，根据标准中给定的公示，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

 （4）若所有稀释度的平板菌落数都大于300，则不能所有都计为TNTC，必须将最高稀释度的两个平板上的菌落逐一地计数，再计算平均数，该平均数为该梯度的菌落总数，其余平板上的菌落数可记为TNTC。

以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

 （5）计算菌落总数时，须严格按照标准要求进行计算。

特殊情况：

①若所有平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数。“最低稀释倍数”并不是固定不变的，与检验人员选取的稀释度有关。如：某样品多次检验后发现菌落总数较高，检验人员在梯度稀释后取1:1000、1:10000、1:100000三个梯度的稀释液倾注平板，最终所有平板上的均无菌落生长，则计算过程为＜1×1000，最终结果为＜1000CFU；若选取1:10、1:100、1:1000三个梯度的稀释液倾注平板，均无菌落生长，则最终结果为＜10CFU。因此，稀释度的选择对于结果存在较大影响，选择时应谨慎。

 

②最低稀释度两个平板只有一个平板上长了1个菌落，若为固体样品且本次检验的最低稀释倍数为1:10，此时计算过程为（1+0）/2×10=5，由于默认固体样品最小检出量为10CFU，故本次检验的菌落总数结果为10CFU。注意：对于该情况一直存在争议，不同的检验人员可能做法不一，有人保留为5CFU，有人保留为10CFU，并无固定做法。（建议检验人员保持一贯做法，不要随意更改）

举例如下：

 

十一、对于水产品、冷冻食品、速冻食品等菌落总数含量较高、限量值较大的食品类别，建议多增加稀释梯度（可稀释至10-4甚至10-5），避免稀释度较低、浓度较大导致培养后平板上菌落蔓延、弥散而难以计数甚至无法计数。

 

 

GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验

 

第一法 金黄色葡萄球菌定性检验

 

1、7.5%氯化钠肉汤增菌培养：

（1）若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；

 

（2）若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。

 

2、血平板：36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。

 

3、接种原则：

（1）革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；

 

（2）若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；

 

（3）5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。

 

4、BP平板：36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。 若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。  

 

5、血浆凝固酶试验：

（1）根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。

 

（2）同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。

（3）若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。

 

第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法

 

1、取1mL样品稀释匀液接种3个BP平板（此处并未严格按照标准中0.3mL、0.3mL、0.4mL精确取样，由于如此操作会增加试验时间，无法在15min内完成试验）。

 

2、涂布时不要触及平板边缘（会导致样液涂抹不均匀，大部分汇集于边缘）。

 

3、可用同一根涂布棒从低稀释度到高稀释度进行涂布（不用换涂布棒）。

 

4、涂布完成后应稍微放置一段时间使培养基吸收样品匀液。

 

5、若水珠较多，可正置于培养箱中1～2h后再倒置培养。

 

6、36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

 

第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数法

 

1、样品稀释同菌落总数，取3个连续稀释度稀释液（或包括液体样品原液），每个稀释度接种3管7.5%氯化钠肉汤，每管接种1mL，36±1℃培养18h后观察，若出现浑浊则接种至BP平板，若无变化则继续培养至24h后再接种至BP平板。

 

2、划线接种至BP平板，36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

 

3、根据证实后的阳性管数差MPN表得出结果。

 

GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

（标准补充）

 

1、称取25g样品于可封口的均质袋中，再倒入BPW至250g，尽量排去均质袋中的空气后再封口、均质后直接置于36±1℃培养箱中培养过夜（标准要求为8～18h，一般培养过夜后第二天早晨继续下一步试验）

 

2、TTB、SC应酌情配制，现配现用，不宜久置。若BPW放入培养箱的当日时间允许，则可将TTB、SC灭菌、配制、分装后冷藏以备第二天实验；若当日时间不允许，则次日早晨灭菌、分装，下午即可转接培养。

 

3、TTB：灭菌条件为121℃15min，与一般试验耗材、培养基的灭菌条件一致，故在灭菌时可考虑同时灭为一锅。且须同时灭一些带塞（可带塑料盖子）的小试管、10mL移液枪枪头、1mL移液枪枪头，在灭菌完成后温度降至不烫手时，轻轻晃动三角烧瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混匀，每100mLTTB中加入1支碘液（陆桥，P-72）、1支0.1%煌绿（陆桥，P-73），充分摇匀至整瓶TTB呈现绿色，此时用移液枪准确吸取10mLTTB至已灭菌的小试管中，盖上盖子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中，于42℃培养18～24h（若时间允许、或18h后观察试管仍无浑浊，则培养至24h，否则培养至18h即可）。

 

4、SC：仅需加热煮沸灭菌（因SC易溶于水，煮沸即可，无需过度加热），冷却至不烫手时用移液枪吸取10mL分装至已灭菌的小试管中，盖上盖子。取1mLBPW增菌液至1管SC中，于36±1℃培养18～24h（若时间允许、或18h后观察试管仍无浑浊，则培养至24h，否则培养至18h即可）。

 

5、BS、XLD应酌情配制，在用前一天配制后备用（两者仅需加热灭菌、不添加任何添加剂，无需过度加热）。BS在不烫手时即可倒成平板，否则容易沉淀或凝固，且在倒平板前应充分摇匀以防止有效成分沉淀于底部（棕色或棕黄色颗粒物）。XLD过度加热会造成琼脂不易凝固、划线时容易划破，甚至不凝结成块、无法倒置。

 

6、XLD培养条件：36±1℃培养18～24h。18h后观察，若TTB、SC增菌液都有菌落生长，则可挑取任意生长良好的菌落进行生化鉴定试验；若只有其中一种增菌液有菌落生长、或两者都无菌落生长，则继续培养至24h再观察，此时无论菌落生长与否都不再继续培养，只要其中任一增菌液有典型或可疑沙门氏菌生长则挑取进行生化试验。

 

7、生化鉴定：

（1）一般情况下，XLD上的任一增菌液长菌，则BS上对应增菌液也会长菌，此时若已挑取XLD上的菌落进行生化试验，则无需挑取BS上的菌落；或XLD上的两种增菌液长了形态特征完全相同的菌落，则挑取任一典型菌落进行生化鉴定即可，且无论BS上菌落生长如何，都不再挑取BS上的菌落进行生化试验。

 

（2）若出现XLD未长菌的增菌液在BS上长菌，则还需挑取BS上的该菌落进行生化试验。

 

（3）用生化鉴定试剂盒进行生化鉴定，依据产品说明书判断阴性或阳性，再根据标准中表2～表5的内容逐步进行判定（即生化鉴定试剂盒是将标准中的所有鉴定步骤同时完成，但判定时依然要按照标准逐步判定，只要其中任一阶段可判定为非沙门氏菌属，则不再往下判定，鉴定试验即终止）

 

（4）若判定为沙门氏菌属，则可选择进行或不进行血清凝集试验。首先应确定该菌落无自凝性，否则无法进行血清学试验。