一、消毒灭菌方法

目前，常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。

1.干热灭菌法

是利用恒温干燥箱内160℃～170℃的高热，并保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一，在进行微生物检测工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。

2.湿热灭菌法

压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和培养基的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为0.10-0.11MPa，维持20～30min即可达到灭菌效果。

3.射线灭菌法

利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。

4.过滤除菌法
是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养基等。

目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。

5.化学消毒剂消毒法
用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲醛、高锰酸钾、70%～75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0.1%新洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材料的灭菌；利用甲醛加高锰酸钾[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。在使用时应注意安全，特别是用在皮肤或实验材料上的消毒剂，须选用合适的药剂种类、浓度和处理时间，才能达到安全和灭菌的目的。

6.抗生素抑菌法
主要用于培养基，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。

二、不同种类物品及培养物的消毒灭菌方法
 

1.无菌操作室灭菌
由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌，熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]进行无菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30min，进行空气灭菌。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。

2.培养液灭菌
培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少也应在4小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。

使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.035~0.040 MPa时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加热，当压力表读数达到0.10~0.11MPa为121℃，保持15~20min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。

在121℃的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在0.10~0.11MPa、121℃。消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关(表1)，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法消毒灭菌。首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置在无菌场所，固体培养液在40℃左右琼脂即将凝结前，加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械灭菌

玻璃器皿可进行干热灭菌或高压蒸汽灭菌，但在蒸汽灭菌后最好及时烘干水分。对不能进行高压蒸汽灭菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在无菌操作台面上晾干的同时，用紫外线重复杀菌。实验室还可以用环氧乙烷灭菌袋对塑料器皿进行消毒，消毒后的器皿要充分散气2～4小时后才可使用。无菌操作所用的各种器械，一般采用干热或高压蒸汽灭菌，或用75%酒精浸泡，然后在无菌操作台面上晾干的同时再用紫外线重复杀菌；在使用期间可多次对其进行酒精灯火焰灼烧灭菌。

4.培养材料的消毒灭菌
采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢(10~12%，浸泡5~15 min)、过氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。

三、灭菌程序验证内容

撰写验证方案及制定评估标准。

确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行。

确认关键设备控制仪表在规定的参数范围内能正常运行。

采用被灭菌物品或模拟物品进行重复实验确认灭菌效果符合规定。

完善文件记录，撰写验证报告。

四、灭菌程序运行监控

关键参数应在验证确定的范围内：温度、压力、时间、湿度、灭菌气体浓度、辐照剂量等。

灭菌程序定期验证，时效不超过半年。

灭菌设备或程序发生变更重新进行验证。

五、灭菌保证

灭菌效果与灭菌前产品污染程度及污染菌特性有关，把握微生物污染水平及污染菌耐受性，注意各个环节降低污染程度。

灭菌冷却阶段防止已灭菌物品再次污染。

适用生物指示剂、化学指示剂等监控灭菌结果。

六、生物指示剂

基本要求：

菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。

菌种应无致病性。

菌株应稳定，存活期长，易于保存。

易于培养。若使用休眠孢子，孢子含量在90%以上。

七、常用生物指示剂

湿热灭菌：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（ATCC7953等，活孢子数为5×105～5×106个/片)。

干热灭菌：枯草芽孢杆菌孢子（ATCC9372等，活孢子数为5×105～5×106个/片)。

辐射灭菌：短小芽孢杆菌孢子（ATCC27142等，活孢子数为5×107～5×108个/片)。

八、小结

高压蒸汽灭菌法：用高温加高压灭菌，不仅可杀死一般的细菌，对细菌芽胞也有杀灭效果，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。主要用于能耐高温的物品，如金属器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡胶及一些药物和部分培养基的灭菌。