培养基在使用之前必须进行灭菌处理，将其所含活菌全部杀死或全部除去。常用的灭菌方法有过滤除菌、干热灭菌、湿热灭菌及辐照灭菌等。其中，湿热灭菌法又包括四种方式:煮沸法、流动蒸汽灭菌法、间歇灭菌法和压力蒸汽灭菌法。通常来说，使用比较多的是压力蒸汽灭菌法。

 

但是对于有些培养基来说,高压条件会损坏培养基中的某些成分,不利于培养基的使用，所以只能采用煮沸灭菌的处理方法。本文主要就煮沸灭菌方法进行讨论。

 

有关煮沸灭菌的描述,通常有如下几种方式:

a、称取本品41. 5g,加热溶解于1000mL蒸馏水中,煮沸不要超过2分钟。无需高压灭菌。临用时制备，不得超过3小时。

 

b、称取本品50. 3g,加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至45-50℃， 摇匀，倾入无菌平皿备用。无需高压灭菌。

 

c、称取本品89g,煮沸溶解于1000mL蒸馏水中，冷至45-50℃时，倾入无菌平皿，备用。注:无需高压灭菌。

 

d、称取本品57g,加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，不要过分加热，冷至50-55℃时，倾入无菌平皿,部分开盖干燥2h,然后盖上，备用。无需高压灭菌。在24小时内使用。 

这些方法描述中，都特别强调“无需高压灭菌”、“不要过分热”、“煮沸充分溶解”,那么究竟该怎样操作，才能达到既灭菌完全又尽量降低对培养基的破坏呢?

 

1、关于煮沸方式，有人提出可以隔水煮沸，但经过反复试验，发现这种煮沸方式存在两大弊端:①温度不够，达不到灭菌效果;②经隔水煮沸的含琼脂培养基,在水浴的过程中易出现分层现象。

2、为了对培养基进行有效煮沸灭菌,根据我们实践摸索，建议如下操作:

①准备好电磁炉和搪瓷缸(不要用铁质容器) ;

②将培养基按比例加水，称量至搪瓷缸中，用玻璃棒不断搅拌，直至完全溶解、无明显团状物或颗粒;

③将搪瓷缸置于电磁炉上，大火烧开，期间持续搅拌,避免糊底;当液面完全沸腾后，立即将搪瓷缸从电磁炉上拿开,算是一次煮沸操作;液面回落后，立即放回电磁炉,重复上面的步骤;总共煮沸3次即可。

④将煮好的培养基冷却至需要的温度,进行倾注平皿等操作。

 

 

1、补水

加热煮沸的过程，培养基中的部分水分会蒸发掉，造成水分偏少，影响培养基的质量(如平板强度等)，导致菌落形态等结果的偏差，因此为了尽量减少误差,需要在煮沸之前，向搪瓷缸中补加适量培养基配制用水，经验估计,通常每煮一缸培养基需补加15- 20mL水，实际操作中，需根据各实验室的具体情况(容器大小及装量)进行摸索。

2、溶解

所有的培养基，在煮之前必须搅拌至完全溶解，不允许将尚有成团培养基的状态下，直接进行加热煮沸,那样很容易出现灭菌不彻底的现象，尤其是有些含琼脂的培养基,甚至会有部分琼脂不能彻底溶解，导致倒出的平皿上有明显的麸皮状琼脂小颗粒，或者有些含有染料的培养基也可能出现染料颗粒,都会影响培养基的使用。

 

3、搅拌

煮沸全程必须持续不断搅拌,以免糊底。

4、防烫

液面沸腾后，要及时将搪瓷缸从电磁炉上取下，以免液体沸出，造成培养基沾染或烫伤操作人员。