1、样品的稀释

固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min～2 min,制成 1:10 的样品匀液.

液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中,充分混匀,制成 1:10 的样品匀液.

2、用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）,振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液.

3、制备 10 倍系列稀释样品匀液.每递增稀释一次,换用 1 次1 mL 无菌吸管或吸头.

4、根据对样品污染状况的估计,选择 2 3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）,在进行 10 倍递增稀释时,吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿.同时,分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照.

5、及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 ±1 ℃℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀.

6、培养 :待琼脂凝固后,将平板翻转,36 ±1 ℃℃培养48 h±2 h.水产品 30 ±1 ℃℃培养 72 h±3 h.如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 mL）,凝固后翻转平板,条件进行培养.

 

7、菌落计数

可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量.菌落计数以落

形成单位（colony-forming units,CFU）表示.

8、选取菌落数在 30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数.低于 30 CFU的平板记录具体菌落数,大于 300 CFU的可记录为多不可计.每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数.

9、其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以代表一个平板菌落数.

10、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数.