1. 原理：1mL水样在营养琼脂培养基上、在有氧条件下36℃±1℃培养48h后，所得1mL水样中的菌落总数的方法。

2. 营养琼脂培养基

   成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化钠5g；琼脂10~20g；纯水1000mL

   制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌20min，0~4℃冷藏保存。

3. 实验步骤

   生活饮用水：

   以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1mL充分混匀的水样，注入无菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀，每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

   待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数。

    

   水源水：

   以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1：10稀释液；

   用无菌吸管或移液器吸取1：10的稀释液1mL注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1：100稀释液；

   按同法依次稀释成1：1000、1：10000等稀释度的液体备用。每稀释一个稀释度，应更换一次1mL无菌吸管或吸头。

   用无菌吸管或移液器吸取2个~3个适宜稀释度的水样1mL，分别注入无菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。

   
   

4. 实验数据处理

   结果报告：可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

    

   同一稀释度，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数；若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后×2以代表全皿菌落数。然后再求得该稀释度的平均菌落数。

   不同稀释度的选择及报告方法，见下表。

   

   

    

四、测定方法——酶底物法

1. 原理：

   利用复合酶技术,在培养基中加入多种独特的酶底物,每一种酶底物都针对不同的细菌酶设计,且包含最常见的介水传播的细菌,所有的酶底物在被分解时均产生相同的信号。水样检测过程中,水样中存在的细菌分解一种或者多种酶底物,之后产生一个相同的信号,在检测菌落总数时,这个信号即为在波长366 nm紫外灯下所产生的荧光。使用基于复合酶底物技术(Multiple Enzyme Technology)的培养基,其中酶底物被微生物的酶水解﹐在36℃士1℃下培养48 h后能够最大限度地释放4-甲基伞形酮,4-甲基伞形酮在366 nm紫外灯照射下发出蓝色荧光,对呈现蓝色荧光的培养盘孔槽计数并查阅MPN表,可以确定原始水样中最可能的菌落总数。

   本方法未稀释水样的检测范围为<738 MPN/mL。

    

2. 复合酶底物培养基

    

   成分：

   a) 葡萄糖                 1.25 g

   b）无水硫酸镁              0.2 g

   c) 蛋白胨                 5.0 g

   d) 酵母提取物              3.5 g

   e) 4-甲基伞形酮磷酸酯         0.037 5 g

   f)4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷    0.03 g

   g)纯水                 l 000 mL

    

   制法：将上述成分溶解于纯水中,调整pH为6.7～7.3,经0.22 um滤膜过滤除菌。制备好的培养基于2℃~8℃条件下保存备用。

    

3. 实验步骤

   水样稀释：
   检测所需水样为l mL。若水样污染严重,可对水样进行稀释。以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1 mL充分混匀的水样,注入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中,充分振荡混匀后取1 mL进行检测,必要时可加大稀释度,以10倍逐级稀释。
   
   
   接种培养：
   向一无菌试管中加入9 ml制备好的液体培养基；如选用符合要求的成品培养基,则向装有0.l g培养基的试管中加入9 mL无菌生理盐水。取1 mL水样加入上述试管中,涡旋振荡混匀。
   将混匀后的水样倒入培养盘中心位置,将培养盘盖好,放置在水平桌面上﹐紧贴桌面顺时针轻柔晃动培养盘,将待测水样分配到培养盘的所有孔槽中。
   将培养盘90°~120°竖起,使多余的水样由盘内海绵条吸收,将培养盘缓慢翻转过来,倒置放于36 ℃士1℃培养箱中,培养48 h。可叠放培养,不宜超过10层。

    

4. 实验数据处理

   结果计数
   将培养后的培养盘取出,倒置于暗处或紫外灯箱内,在6 W 366 nm紫外灯下约13 cm处观察﹐记录产生蓝色荧光的孔数。如未放置在紫外灯箱内,观察时需佩戴防紫外线的护目镜。培养盘中的84个孔,无论荧光强弱,只要呈现蓝色荧光即为阳性,但海绵条的荧光不计入结果。

    

   

   结果报告
   根据显蓝色荧光的孔数,对照表⒉查出孔数对应的每毫升样品中的菌落总数的MPN值。如果样品进行了稀释,读取的结果应乘以稀释倍数并报告之,结果以MPN/mL表示。如果所有孔均未显荧光,则可报告为菌落总数未检出。

    

   
   

   

   

    

   不同稀释度的选择及报告方法
   选择菌落总数在<738 MPN/mL.范围内的稀释度﹐如果只有一个稀释度的结果符合此范围,则将结果乘以稀释倍数报告结果。
   
   
   若有两个或两个以上稀释度的结果均落在<738 MPN/mL,范围内,则选择稀释度最小的结果乘以稀释倍数报告结果。
   
   
   若所有稀释度的培养盘上均无蓝色荧光,则以未检出报告结果。