（一）样品的采集

1.采样目的

确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。

2.采样原则

采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。

应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。

采样必须遵循无菌操作程，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。

3.采样数量

取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式两份，分别供检验、复检使用，每份样品数量一般不少于200g。

根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。

4.采样方法

采取随机抽样的方式。

直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。

如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至0－4℃。

不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。

在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。

5.样品的保存和运送

样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1－5℃环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。

冷冻样品应存放在－15℃以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在0－5℃冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。

运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。

待检样品存放时间一般不应超过36小时。

 

（二）检验样品的制备

样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

检验冷冻样品前应先使其融化。可在0－4℃融化，时间不超过18小时，也可在温度不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟。

检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速翻转25次；如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3分钟。

开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75％乙醇消毒开启部位及其周围。

非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm，也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。

粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。

固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟，或是在无菌生理盐水里放入玻璃珠，充分振荡摇匀。

（三）检验

实验室收到样品后或是自己取样后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。

检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。

实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。

制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。

检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。

 

（四）检验记录和结果的报告

经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。

 

（五）样品的微生物检验流程

 

（六）微生物操作注意要点

无菌操作要求

（1）微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染；

（2）接种细菌时必须穿工作服、带工作帽；

（3）进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用；

（4）接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净；

（5）进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用；

（6）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边；

（7）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

（8）接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处；

（9）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的吸尔球吸取，不得直接用口吸。 

无菌间使用要求

（1）无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有小窗，以备进入无菌间后传递物品；

（2）无菌间应保持清洁，工作后用巴氏消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品；

（3）无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯消毒（30W，1m）时，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；

（4）处理和接种食品样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

（1）灭菌前准备

①所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。

装培养基的三角瓶塞好棉塞，试管盖好盖，用纸包好。

（2）装放

将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

（3）设备检查

①检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

②压力表蒸气排尽时是否停留在零位，盖好盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

③对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

（4）灭菌处理

手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

①高压锅内加入清水（重复使用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。

②将要灭菌的物品放入灭菌锅内，盖好盖子。

接通电源，加热，水沸腾后打开放气阀排气，直到压力表指针降到0.05Mpa时，关掉放气阀。

指针指到121℃时开始计时，达到要求的灭菌时间关掉开关，冷却直到压力降到0.05Mpa即可通过放气阀缓慢放气。

（5）灭菌温度与时间

①不同类型培养基的灭菌温度与时间的关系见下表：

 

②灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查，以免再度污染。

物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。

取出的物品，如外包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。

培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。

取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。

取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。

凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。

每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

（6）有毒有菌污物处理要求

微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。

经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。

经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。

染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小时，再经121℃，30min高压灭菌。

涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗涤。

打碎的培养物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。 

（7）玻璃器皿的清洗要求

①目的  

为了保证微生物实验顺利进行，保证实验结果的准确性，不影响实验进度，必须把器皿彻底清洗干净。

②注意事项

任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。

一般新的玻璃器皿用2%的盐酸液浸泡数小时，后用水冲洗干净。

用过的器皿应立即洗涤，放置太久会增加洗涤困难。

强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，以免污染环境水质，必须倒在废水缸中。

含有对人体有传染性病菌的器具，应先煮沸灭菌后再进行洗涤。

难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起，否则使本来无油的器皿沾上了油垢，浪费药剂和时间。

洗涤剂的种类：水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂。

③洗涤方法

含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法：事先应将器皿中的琼脂刮去，然后用清水洗涤，并用试管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自来水（蒸馏水）冲洗。洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。

载玻片及盖玻片的洗涤法：新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗2~3次，最后用蒸馏水换洗2~3次。用过的载玻片及盖玻片，应用纸擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小时，再用蒸馏水冲洗至中性。

移液管、倒管的洗涤方法：新的移液管及倒管先在的５％盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗几次，最后用蒸馏水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液，再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上，再用自来水冲洗至管内壁无残渣，最后用蒸馏水换洗次，晾干后入恒温干燥箱中烘干。

（8）培养基、无菌水的制备

①基本原理

培养基的种类很多，不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型，我们实验室常用的是固体培养基。

②器材

三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、药勺、杜氏小管、硅胶塞（棉塞）、电炉。

培养基的种类

营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基等。

方法步骤

培养基的制备：

称量：根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中。

溶解：用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，至完全溶解，加热至沸腾，拔掉电源，待冷却。

分装：根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜，分装试管一般为管长的1/5（需根据试管的大小而定）。液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。

塞橡胶（棉）塞：装好培养基的试管应塞上橡胶（棉）塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。

包装：三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集中于试管篓。

无菌水的制备：

用10mL移液管量取9.0mL蒸馏水（稀释水）装入试管中。

用250mL量筒量取225mL蒸馏水（稀释水）装入250mL的三角瓶中，可置少许玻璃珠于三角瓶内，塞上橡胶（棉）塞用牛皮纸包扎好，高压灭菌备用。 

（9）设备使用原则

①实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行，其他人员不得随意操作。

②实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行，出现不可排除的故障时，经部门总经理批准，商请专业人员维修。

③实验设备应定期进行计量检测，确保仪器的准确性。

④实验员应爱护仪器设备，使用前应检查，使用后应及时清理清洁，并定期维护保养，下班前应检查设备电源是否关闭。

想了解更多资讯，欢迎关注“食品微生物检测”公众号；

 

添加微信13371394813申请加入微生物检验技术交流群！