一 实验原理：

    2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离.这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息.

二 实验步骤：

1. 样品的溶解

    取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时.其中每隔10～15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70ul,—80oC保存.

2. Bradford法测蛋白含量

    取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量.取 7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul）,然后,各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的 Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用）,摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品 OD值.(测量过程要在一个小时内完成).

3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

    称取2.0mg 的DTT,用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05％ 的溴酚兰,3.5ul（0.5％v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清.在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340ul,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清.

3.2 点样,上胶

    分两次吸取样品,每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3—10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品.注意：胶条使用前,要在室温中平衡30分钟；加样时,正极要多加样,以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极,碱性端对应负极；样品加好后,加同样多的覆盖油(Bio-Rad),两个上样槽必须与底线齐平.

3.3  IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20℃）

       S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)

       S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)

       S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)

       S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)

       S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共计44110vhs, 19.5小时

    其中S1用于泡胀水化胶条,S2和S3用于去小离子,S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

    用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后,在滤纸上吸干（胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸,如果为18cm的胶条要将两头剪去）,再以超纯水冲洗,滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略）,然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下,负极端（即碱性端）向上,放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端,酸性端留有溴 酚兰作为标记）,用平衡液A,平衡液B先后平衡15min.  注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁.

    平衡第二次时,在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片,长度与一向胶条的宽度等同,然后吸取煮好的Marker,转入SDS—PAGE胶面上,保持紧密贴合；同样在第二次平衡时,煮5％的琼脂糖10ml.

4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE 

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

      分离胶：（T=8％  80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED

      30 ％ 丙烯酰胺储液    21.28ml

      分离胶buffer           20ml      10％APS 220ul     TEMED 44 ul

      双蒸水                   38.72ml 

      浓缩胶：（T=4.8％   10ml）

      30 ％ 丙烯酰胺储液     1.6ml

      浓缩胶buffer            2.5ml     10％APS 30ul     TEMED 5ul

      双蒸水                   5.9ml

4.2 灌胶

      将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保鲜膜封好.

4.3 转移

      剪两个小的滤纸片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE胶面的一端.然后,将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5％的琼脂糖溶液在胶面 上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶 面,其中不断补加5％的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡.

4.4 跑胶

     浓缩胶  13mA         分离胶  20mA        共约5.5个小时

5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）

5.1  固定   30min    无水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超纯水定容至500ml

5.2  敏化   30min    无水乙醇 150ml

                         Na2S2O3•5H2O  1.5688g

                         无水乙酸钠          34g  

                         先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml

5.3  洗涤   5min  ×  3次

5.4  银染   20min     AgNO3   1.25g   用超纯水定容至500ml

5.5  洗涤   1min  ×  2次

5.6  显影             无水Na2CO3    12.5g   用超纯水定容至500ml

                       甲醛(37％)0.1ml, 临时加

5.7  终止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超纯水定容至500ml

5.8  洗涤   5min  ×  3次

    注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水,尽量减少离子的影响.

B实验相关试剂配制

1.Bradford 工作液

95％乙醇             25ml       先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷

85％磷酸             52ml       酸,最后超纯水定容至500ml.过滤后置于棕色瓶

考马斯亮兰G250   0.035g     外加油皮纸保存（Bradford不稳定,一周内有效） 

2.裂解液

尿素                 8M

硫脲                 2M

CHAPS             4％

DTT                 60 mM

Tris—base          40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5％的Pharmalate）

3. 水化液储液

尿素                 8M 

硫脲                 2M

CHAPS             4％

Tris—base          40 mM

4. 分离胶buffer (pH8.8)                         250ml

SDS                  0.4％                   1g

Tris—HCl           1.5M                 45.4275g

5. 浓缩胶buffer (pH6.8)                         100ml

SDS                  0.4％                  0.4g

Tris—HCl           0.5M                  6.07g

6.凝胶储存液（30％的丙烯酰胺）               250ml

Acr                  29.2％                  73g

Bis                   0.8％                   2g

7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）

甘氨酸             43.2g                   36g

Tris                  9g         或           7.5g

SDS                 3g                      2.5g                

超纯水定容至3000ml                    超纯水定容至2500ml

8.0.5M Tris —HCl pH 6.8储液

6.1g Tris先用30ml超纯水溶解,再用46ml,3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml

9.平衡液储液

脲（即尿素）         36g

甘油                    30％                  30ml

SDS                    1％                   1g

0.5M Tris—HCl pH6.8  10ml              超纯水定容至100ml

10. 平衡液A（一根胶条）

DTT                   20mg

平衡液储液           10ml

11．平衡液B（一根胶条）

碘乙酰氨             300mg

平衡液储液           10ml

0.05％溴酚兰          15ul              (平衡液A、B均需临时配制)

12．0.5％琼脂糖10ml

琼脂糖                0.05g

电极缓冲液           10ml

溴酚兰                25ul

补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4℃备用.