园友jerrycs:

    厌氧微生物在自然界分布广泛,种类繁多,其生理作用日益受到人们的重视.双歧杆菌是专性厌氧菌,对氧气非常敏感,因此,双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境.

    双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃,最低生长温度25℃~28℃,最高43℃~45℃.初始最适pH 6.5~7.0,在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长.其细胞呈现多样形态,有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形.单个或链状、V 形、栅栏状排列,或聚集成星状.革兰氏阳性,不抗酸,不形成芽孢,不运动.双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地.双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌,定殖于肠道内,是肠道的优势菌群,占婴儿消化道菌丛的92%.该菌与人体终生相伴,其数量的多少与人体健康密切相关,是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌.该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障,从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌,痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭,保持机体肠道内正常的微生态平衡;能激活巨噬细胞的活性,增强机体细胞的免疫力;能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素;能控制内毒素血症和防治便秘,预防贫血和佝偻病;可降低亚硝胺等致癌物前体的形成,有防癌和抗癌作用;能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化,具有抗衰老功能.

    双歧杆菌的培养方法很多,如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法.这些方法都需要特定的除氧措施,操作步骤多,较繁琐.本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术,亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术.以后这项技术又经历了几十年的不断改进,从而使亨盖特厌氧技术日趋完善,并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术,而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术.该技术的优点是:预还原培养基制好后,可随时取用进行试验;任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件.

    目前,双歧杆菌鉴定的方法有很多种.近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建,分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性;RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型.一般来讲,我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法,主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等.

 

实验用具

    高纯氮气 厌氧管 注射器 培养箱 冰块 水浴锅 镊子 记号笔 MRS培养基 细菌生化微量鉴定管 酒精棉球 瓷盘 振荡器 铜柱除氧系统 定量加样器 恒温水浴 载玻片 显微镜 恒温培养箱 超声波破碎仪 滤纸 层析缸 酒精灯 封口膜 厌氧罐 等.

实验方法与步骤

1.铜柱系统除氧

    铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管.此管的大小为40～400mm,两端被加工成漏斗状,外壁绕有加热带,并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度.铜柱两端连接胶管,一端连接气钢瓶,另一端连接出气管口.由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2,故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时,铜和气体中的微量O2化合生成CuO,铜柱则由明亮的黄色变为黑色.当向氧化状的铜柱通入H2时,H2与CuO中的氧就结合形成 H2O,而CuO又被还原成了铜,铜柱则又呈现明亮的黄色.此铜柱可以反复的使用,并不断起到除氧的目的.当然H2源也可以由氢气发生器产生.

 

2.预还原培养基及稀释液的制备

    制作预还原培养基及稀释液时,先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧,而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中,一般琼脂培养基装4.5～5.0mL,稀释液装9mL,并插入通N2气的长针头以排除O2.此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色,说明试管内已成为无氧状态,然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖,灭菌备用.

 

3.分离

（1）编号

取五支无菌水试管,分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5.

（2）稀释

在无菌条件下,用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品,加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中,用震荡器将其混合均匀,制成10-1稀释液.用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中,制成10-2稀释液.依此进行10倍系列稀释,至10-7,制成不同样品稀释液.通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数.

（3）滚管分离

1）滚管

将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化,置46-50℃恒温的水浴中,待用,用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL,分别注入待用的试管中,然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动,带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层.

2）分离

生成的菌落需挑取出来,镜检其形态及纯度.如尚未获得纯培养物,需再次稀释滚管,并再次挑取菌落,直至获得纯培养物为止.待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定,做好标记.然后将培养基试管固定于适当的支架上,打开试管胶塞,同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内.同时,另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头.将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内,找准待挑菌落,轻轻吸取,转移至液体试管内,加塞.37℃培养.培养 24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度.

4.计数并镜检

（1）计数

液体纯培养物经系列稀释后,按上述滚管法培养.然后对固体滚管计数,计算每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量.公式如下:

双歧杆菌数量cfu/g（mL）样品=0.1mL滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数

（2）镜检

挑取特征性菌落制片,革兰氏染色后镜检,观察菌体形态.

 

5.菌种鉴定

（1）双歧杆菌特定酶的检测

    利用果糖-6-磷酸盐对分离得到的菌种进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）的测定,初步确定菌种是否为双歧杆菌属.F6PPK测定的操作如下:

①将从样品中分离出的双歧杆菌培养于厌氧液体改良MRS培养基中37℃生长24 h.

②将菌液4400 rpm离心10 min,收集菌体,缓冲液ⅰ洗涤2次,最后溶于约4 mL缓冲液ⅰ中,制成细菌悬液.

缓冲液ⅰ:现用现配.取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH2PO468.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐.

③用超声波粉碎仪,400 W条件下;每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min,至菌体溶液呈半透明.

④破碎后,取0.5 mL于离心管中,加试剂ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保温30 min.

ⅱ6 mg/mL氟化钠加10 mg/mL碘乙酸钠.

ⅲ果糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液.

⑤加试剂ⅳ0.750mL,室温10 min.

ⅳ现用现配.盐酸羟胺139 mg/mL.酸性极强,用氢氧化钠中和至pH6.5.

⑥加试剂ⅴ和ⅵ各500 µL,室温5 min.

ⅴ三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL.

ⅵ4 M HCl.

⑦加试剂ⅶ500 µL,显色.红褐色或红紫色为阳性,黄色为阴性.

ⅶ0.5 g/100 mL FeCl3·6H2O溶于0.1 MHCl.

（2）乙酸、乳酸等有机酸的测定——纸层析法

①层析滤纸的制备——将层析滤纸剪成1.5cm*11cm的长条状,在距层析纸一端约4cm处用铅笔划线确定点阳线,使用前充分干燥.

②配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5

③配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液

④制备待测样品——将菌种37℃培养24h后离心,收集上清液

⑤点样——用毛细管分别吸取发酵液,多次点样于滤纸条上,样点直径不宜超过2mm,平衡2h

⑥层析——将点好样的层析纸放入,使点有样品的一端浸在展开剂中,但不可浸及样点.观察展开情况,待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处,取出层析纸.

⑦ 显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂,待层析液挥发之后,向层析滤纸喷洒并计算Rf值.

    注释:物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值Rfvalue又称Rf值)来表示:

Rf=原点到层析中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

    在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关,是一个定性分析的重要参数.

（3）糖发酵试验

    糖发酵实验是最常用的生化反应,在肠道细菌鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖的能力上有很大差异,有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）;有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖.酸的产生可以利用指示剂来断定.在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）],当发酵产酸时,可使培养基由紫色变为黄色.气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明.

    本实采用现成的细菌生化微量鉴定管 ,鉴定管的种类如下:

    乳糖 麦芽糖 甘露糖 甘露醇 蔗糖 阿拉伯糖D-核糖 木糖（木胶糖） 半乳糖 松三糖 山梨糖 淀粉 水杨素 葡萄糖酸盐 草糖（海藻糖） 血清菊糖 棉子糖 果糖 蜜二糖 纤维二糖

    具体实验步骤:

① 将菌液进行适当稀释,之后在无菌环境下,取一定量的稀释液注入生化鉴定管中,用无菌封口膜封口.

② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中,充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养.

③24h后观察各管中液体变颜色情况,若变色则为阳性,反之阴性,对照凌代文编著的《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》“鉴别双歧杆菌属内种的特征”表即可初步确定其种别.