革兰染色法(Gram stain)是细菌学上最经典的、使用最广泛的一种染色方法.由丹麦细菌学家革兰(Christian Gram)于1883年创立.细菌染色后,不仅可以观察其形态,而且可根据染色结果将细菌分为两大类,即革兰阳性菌(G+菌)和革兰阴性菌(G-菌).

1、原理：

(1)G+菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚),且脂质含量少,乙醇不易渗入脱色；G-菌细胞壁结构疏松(肽聚糖层薄),且脂质含量多,乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色.

(2)G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐,可与碘、结晶紫牢固结合,使已着色的细菌不被乙醇脱色.G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小,易被乙醇脱色.

(3)G+菌等电点比G-菌低,在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多,故与带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固,不易被乙醇脱色.

2、应用

革兰染色法的实际应用意义有三：

(1)按照革兰染色法可把细菌分为G+和G-两大类；

(2)G+菌和G-菌的致病性不同,所致疾病各异；

(3)对G+和G-菌,选择不同抗菌物治疗.

3、材料　

(1)葡萄球菌和大肠埃希菌培养18～24h后的混合菌液.

(2)兰染色液：结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红或沙黄染液.

(3)载玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、显微镜等.

4、方法

标本片制备

(1)载玻片准备：取一张清洁载玻片,用蜡笔在其背面画出二个有一定间隔、直径约1～2cm的涂抹范围,用数字或符号做好标记.

(2)涂片：将接种环在火焰上烧灼灭菌,冷却后取菌液直接涂布在标记的涂抹范围内.接种环在火焰上烧灼灭菌.

(3)干燥：涂片最好在室温下自然干燥,或将标本面向上,置于离酒精灯火焰约半尺高处缓慢烘干,切不可放在火焰上烧干.

(4)固定：将干燥后的涂片用片夹夹住,使涂抹面向上缓慢通过火焰3次,然后自然冷却.固定即可杀死细菌,并使细菌固着于玻片上,以免染色时脱落；又可使细菌蛋白凝固,而易着色.

革兰染色法：

(1)初染：在固定好并冷却了的涂片上滴加结晶紫染液1～2滴,作用1min后,用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去.

(2)媒染：滴加卢戈(Lugol)碘液数滴,作用1min后水洗.碘液是媒染剂,使结晶紫染液与细菌结合更牢固.

(3)脱色：滴加95%酒精数滴,轻轻晃动玻片,使玻片上流下的酒精液无紫色为止(约需0.5～1min),流水冲洗.

(4)复染：滴加稀释复红(或沙黄)染液数滴,作用1min后流水冲洗.最后用吸水纸印干标本片或自然干燥后,玻片上滴加香柏油,用油镜观察.

5、结果

G+菌染成紫色；G-菌染成红色.

6、影响因素

⑴操作因素：涂片太厚或太薄,菌体分散不均匀,可影响染色结果.固定时避免菌体过份受热.脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握.

⑵细菌因素：不同时间培养物,革兰染色结果有差异,如葡萄球菌幼龄菌染成紫色.而老龄菌被染成红色.细菌染色时最好用18～24h的细菌培养物.

⑶染液因素：所有染色液应防止水分蒸发而影响浓度,特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用.脱色酒精以95%浓度为宜,若瓶密封不良或涂片上积水过多,可使酒精浓度下降而减弱其脱色能力.

二、细菌荚膜染色法(Hiss法)

1、原理与应用　

细菌荚膜是细菌细胞壁外面的一层粘液性物质.其对染料的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染色,即使菌体和背景着色而荚膜不着色.因此在菌体周围呈一透明圈.由于荚膜含水量在90%以上,染色时一般不用热固定,以防荚膜皱缩变形.荚膜染色法用于有荚膜细菌

如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌及产气荚膜梭菌的鉴定.

2、材料

⑴荚膜菌液

⑵结晶紫酒精饱和液5ml,加蒸馏水95ml 混合液.

200g/L⑶硫酸铜水溶液.

3、方法

将荚膜菌涂片,在空气中自然干燥,不需加热固定.滴加结晶紫染色液,在火焰上微微加热,使玻片上染液冒蒸汽为止,不要水洗,再用200g/L 硫酸铜水溶液冲洗染液,切勿用流水冲洗.用吸水纸吸干后油镜观察.

4、结果

细菌菌体呈紫色,荚膜呈淡紫色或无色.

三、细菌鞭毛染色法

1、原理与应用

细菌鞭毛为细菌的运动器官.其形态细长,直径约10～20nm,需用电子显微镜才能观察到.若用特殊染色使鞭毛增粗并着色,则在普通光学显微镜下也可观察到.鞭毛染色方法很多,但原理基本类似,即在染色前先经媒染剂处理,使鞭毛增粗,然后再进行染色.

2、材料　

(1)变形杆菌6～8h血琼脂平板培养物.

(2)染色液.

A液：200g/L钾明矾液(加温溶解)20ml,50g/L石炭酸液50ml,200g/L鞣酸液(加温溶解)20ml.

B液：复红酒精饱和液.

取A液9份和B液1份混合后立即过滤.滤液放置6h后,使用最佳.

（3）蒸馏水管

3、方法

(1)细菌标本制备：取变形杆菌血琼脂平板培养物,仔细从菌膜伸展最远处挑取菌少许,轻轻放入蒸馏水管中,经数min使其自行分散,再3725℃～30min.

(2)涂片：取上述菌液一接种环,轻轻滴于载玻片上,使成薄膜.涂抹时接种环随水滴移动,切勿与玻片相磨,以免鞭毛脱落.

(3)染色：涂片自然干燥(勿用火焰固定)后,加染色液作用1～2min ,水洗、吸干、镜检.

4、结果

鞭毛呈淡红色,菌体呈红色.

四、细菌芽胞染色法

1、原理与应用

芽胞具有高度的折光性,外膜致密,渗透性低,故普通染色法不易使其着色,芽胞染色法是根据芽胞既难以着色,而一旦着色又难以脱色的特点设计的.所有芽胞染色法都基于同一个原则：采用着色力强的染料,并加热以促进标本着色,然后使菌体脱色,而芽胞上的染料仍保留,经复染后,菌体和芽胞呈现不同的颜色.

2、材料

(1)破伤风梭菌48～72h培养物

(2)石炭酸复红液、碱性美兰液、95%酒精

3、方法

(1)将破伤风梭菌培养物涂片,自然干燥,火焰固定,滴加石炭酸复红液,并加温至产生蒸汽(不可煮沸)约5min,防止染液干涸,随时补充,待载玻片冷却后,水洗.

(2)用95%酒精脱色2min,水洗.

(3)滴加美兰染液复染30sec,水洗,待干,镜检.

4、结果

芽胞呈红色,菌体呈蓝色.

五、抗酸染色法

1、原理与应用

结核分枝杆菌对苯胺染料一般不易着色,若加温或延长染色时间使其着色后,再用3%盐酸酒精处理也不易脱色,经此染色后,结核分枝杆菌及其他分枝杆菌呈红色,而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色.

2、材料

(1)结核病人痰

(2)抗酸染色液

(3)玻片、片夹、滤纸片、竹签、空平皿、污物盆.

3、方法

(1)取洁净的竹签沾取痰中血丝或脓性痰,在清洁无油脂玻片上涂开.涂抹区约拇指盖大.用过的竹签放到空平皿内待高压灭菌.

(2)涂片自然干燥后,用片夹挟住玻片一端,通过火焰固定.

(3)涂抹面用滤纸片盖上,然后往滤纸片上滴加石炭酸复红染液,使滤纸片完全被染液浸湿,持玻片在小火上加温片刻然后离开火焰,此时可见到玻片上冒出蒸气.待蒸气消失后再加温,如此反复3～4次,约5min,加温时随时添加染液勿使纸片干涸.

(4)玻片冷却后,用接种环挑去滤纸扔到污物盆内,流水冲洗玻片.

(5)滴加3%盐酸酒精脱色,至涂抹均匀部位基本没有红色再脱下为止,水洗.

(6)滴加吕氏美蓝染液30sec,水洗.

(7)吸干、镜检.

4、溶液配制

萋－尼(Zichl-Neelsen)抗酸染色液

(1)石炭酸复红液：硷性复红4g,溶于95%酒精100ml,作成饱和溶液,再取该饱和液10ml与5%石炭酸溶液90ml混匀即成.

(2)3%盐酸酒精液.

浓盐酸3ml加入95%酒精97ml中即成.

(3)吕(Loeffer)氏美蓝染色液

美蓝2g,溶于95%酒精100ml中,作成饱和液.再取该饱和液30ml与0.01%氢氧化钾水溶液100ml混合均匀即可.

六、奈瑟染色法

1、材料

(1)染液甲

第一液：美兰1g,95%酒精30ml,冰醋酸50ml,蒸馏水100ml.

第二液：结晶紫1g, 95%酒精10ml, 蒸馏水300ml.

以上第一液二份,与第二液一份混合之.

(2)染液乙,黄叱精1或2g,热蒸馏水300ml,待溶解后过滤.

2、染色法

(1)涂片按常规法固定后,滴加奈瑟染液甲液数滴于涂片上,15～30 Sec,水洗.

(2)用奈瑟染液乙液复染10～30秒钟.

(3)迅速用水洗,吸干、镜检.

3、结果

菌体呈鲜明黄色、异染颗粒呈深紫兰色.