热酚提取法的原理是将细菌悬液加于热酸——水混合液中,冷却,离心混合液可分为水溶液层,内含水溶性脂多糖及核酸等及酸层、内含蛋白质。近年来发现在酸层中也含糖类。经离心后沉淀含细胞残体。
主要设备
高速离心机,水浴锅,冰箱,试管,超声仪,透析袋等。
实验步骤
1. 热酚提取法:
1) 细菌浓悬液用盐水经2500转/分,20分钟离心洗涤一次。
2) 将沉淀的菌混匀于蒸馏水中,放66℃水浴,然后滴加等量的90%热酚溶液(预热至66℃),边加边摇,而后在66℃水浴中搅拌25分钟。
3) 在水浴中冷却,于4℃冰箱过夜。
4) 以2000转/分离心15分钟。
5) 将上层水溶液吸到另一试管中。
6) 剩下的酚层及残渣组分可再加上述同量水在热水浴中搅拌30分钟,冷却,离心,取上层水溶液。将两次提的水溶液混合,置透析袋中于生理盐水中透析2天,其间换几次盐水,以除去酚。
7) 透析后的水溶液层经浓缩(如用聚乙二醇在透析袋外层涂抹以除去水分)。即成粗制脂多糖,于冰箱内保存备用。
2. 超声波处理法
1) 获得的菌液经2500转/分,20分钟离心洗涤1—2次,将沉淀配成2倍于湿菌浓度的浓菌液。
2) 用超声波发生器中频(约相当于12000cps)处理20分钟。
3) 处理液经3000转/分,离心30分钟,吸取上清液即为脂多糖抗原。置4℃冰箱保存备用。
3. 煮沸法
将培养后得到的浓菌液沸水浴煮沸2小时。置冰箱静置两星期以上(使菌体残渣自由下沉)。3000转/分离心30分钟,取上清夜即为粗脂多糖抗原,置冰箱中保存备用。