一、验证方案的起草与批准

    1.验证方案起草

      起草人：       起草时期：

    2.验证小组成员：

    3.验证方案审核

    4.验证方案批准

      批准人：       批准日期：

二、验证方案

    1.验证目的和原理

    1.1验证目的

       为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。

    1.2原理

       通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。

    2.验证方法步骤

    2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格

       按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。

    2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。

    2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“ ”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。

    3.试验实施

    3.1试验前的准备

    3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。

    3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。

    3.1.3试验样品： 

         批号：    批号：      批号： 

    3.1.4培养基：

    3.1.5稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

         以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。

    3.1.6验证用微生物名称及其编号

         实验菌株的来源： 

         编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。

    3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）

    4.验证方法

    4.1菌液的制备

       将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。将黑曲霉接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养5～7天。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50～100cfu的菌悬液。

    4.2实验方法

       供试液的制备：取样品10g（ml）加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇使分散均匀，用匀浆仪混匀，置45℃水浴使胶囊壳溶化混匀，制成1：10均匀的供试液。

       A.样品试验组

       取1:10供试液（相当1g或1ml供试品）10ml，加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，在*后一次冲洗液中加入50~100cfu菌液，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上（接触细菌和样品的面）贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。

       B.菌液组

       取上述制备菌液各1ml加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上（接触细菌和样品的面）贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。

       C.供试品对照组

       取上述1：10供试液10ml，加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，滤完后，将滤膜取出，接触样品的面向上贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。

       D.稀释剂对照组

       取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入50~100cfu菌液，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。

    4.3培养 

       将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在30～35℃下培养48小时，将白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培养72小时，点计菌落数。

    5.试验结果

    5.1产品试验组微生物生长检查情况： 批号： 

    5.2供试品对照组微生物生长检查情况： 批号： 

    5.3稀释剂对照组微生物生长检查情况： 批号： 

    5.4菌液组微生物生长检查情况： 批号： 

    6.回收率计算

    6.1稀释剂对照组菌回收率

       表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%。

    6.2试验组菌回收率

       表中：回收率=（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）÷菌液组的平均菌落数×100%。

    7.结论：

    7.1经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为 %、 %、 %、 %、 %。

    7.2稀释剂回收率为 %、 %、 %、 %、 %。 

       以上验证结果证明，本品 采用上述方法进行微生物限度检查。

       检验人：          复核人：

    8.验证结果评价分析

      质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价，起草验证报告，报验证委员会。

      验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书。对验证结果的评审应包括：

     （1） 验证试验是否有遗漏；

     （2） 验证实施过程中对验证方案有没有修改，修改原因、依据以及是否经过批准；

     （3） 验证记录是否完整；

     （4） 验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需进一步补充试验。

    9.终审批

      验证报告由验证组长审核后，报验证总负责人批准，并签发验证证书。

   
验证报告

      年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证文件对微生物限度检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：

    1、 验证方案在实施过程中未做修改。

    2、 验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内。

    3、 验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实。

    4、 验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。

    5、 组分或检验条件改变时须重新验证。

    以上情况，请验证委员会审批！

    验证小组：        年 月 日