微生物组测序--环境类样本取样方法

1.土壤

1.1 普通土壤

取样容器：1.5-50ml离心管

送样量：扩增子重量≥2g；宏基因组重量≥5g；

1）根据研究设计选择具有代表性的土壤；

2）采样所用工具、塑料袋或其他物品都要事先灭菌，或用采取的土壤擦拭；

3）取 5-10cm处土壤，多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除杂质后再取一定量土壤装入无菌管，每个样品取样2-10g；

4）密封后用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意事项：为防止交叉污染，不建议使用自封袋取样。

1.2 根际土壤

取样容器：1.5ml-50ml离心管

送样量：扩增子重量≥2g；宏基因组重量≥5g；

1）使用的工器具要事先消毒灭菌处理；

2）采集20cm深的根际土壤于50mL的无菌管里，迅速放在液氮里冻存；

3）用20目的筛子过筛，去除植物根、动物残骸以及其他杂质后分装到无菌离心管里，每管3~5g，密封后立即-80℃储存备用。

2. 植物组织

送样量：扩增子重量≥1g；宏基因组重量≥2g；

1）大田或野外获取的材料；

2）取材后需用70%酒精将材料表面的灰尘及泥土冲洗干净，吸干；

3）液氮速冻后，放入预冷的50ml离心管或是封口袋中，用大体积干冰运输。

注意事项：优先选用新鲜采集的样品送样；根，茎，果实组织较大时，切碎后送样。

3. 植物根表面

取样容器：1.5-50ml离心管

1）将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中；

2）加入PBS缓冲液后进行振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,震荡至少2h以上；

3）直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。

PBS浓度和PH有要求：浓度是用1x的，PH值是7.4的，一般买回来的PBS是10x的，我们会稀释到1x。

注意事项：建议优先使用超声波洗涤。

4. 植物内生菌

送样量：扩增子干重≥1g；宏基因组干重≥2g；

1）根据研究目的选取对应的新鲜植物组织；

2）依次用70%无水乙醇浸泡40s，再用2.5%次氯酸钠浸泡10min，每100ml 2.5%次氯酸钠加一滴吐温80；

3）无菌水清洗2-3次，-80℃保存。

5. 水体

取样容器：1.5-50ml离心管

送样量：扩增子直径3-4cm滤膜1-2张；宏基因组直径3-4cm滤膜1-2张；

1）研究目的进行确定水体的取样深度和范围；

2）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45μm的滤膜，取样体积大于5L；对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；

3）水体泥样的采集提供大于5g样本；

4）用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意事项：扩增子项目将3-5L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中；宏基因组项目将30-50L水体过滤到1-2张滤膜（0.22或0.45um）后装入到离心管中。

6. 污泥、海洋沉积样本

1）活性污泥样本取自活性污泥装置中，一般取样量大于20ml，将其置于无菌管中，建议立即提取后-80℃保存；

2）海洋沉积样本根据研究目的进行取样，一般建议取1kg以上的沉积物装入塑料袋中，低温运输并尽快进行提取-80℃保存。

注意：活性污泥样本等一般建议及时提取，样本体积较大，长时间-80℃保存，一方面储存不便，另一方面冻融提取也比较困难，加大了实验工作量及难度。建议提取后保存DNA即可。

7. 空气

1）抽取针对实验目的的空气微颗粒，用不同孔径大小的无菌滤膜筛选目的颗粒（将含颗粒过滤膜装入无菌铝箔内，密封在-80℃长期保存）；

2）截取适量大小过滤膜，置于含有1xPBS 缓冲液的50ml离心管；在4℃条件下，加速度离心2h；

3）温和旋涡处理，0.2μm的Supor 200 PES Membrance Disc Filter 过滤纸重悬液。

注意：由于样本特殊，微生物含量较少，建议多保管备份保存。