一、原理

生化需氧量是指在规定条件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物质，主要是有机物质所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。分别测定水样培养前的溶解氧含量和在20±1℃培养五天后的溶解氧含量，二者之差即为五日生化过程所消耗的氧量（BOD₅）。

二、仪器

1．恒温培养箱。

2．5—20L细口玻璃瓶。

3．1000—2000mL量筒。

4．玻璃搅棒：棒长应比所用量筒高度长20cm。在棒的底端固定一个直径比量筒直径略小，并带有几个小孔的硬橡胶板。

5．溶解氧瓶：200—300mL，带有磨口玻璃塞并具有供水封用的钟形口。

6．虹吸管：供分取水样和添加稀释水用。

三、试剂

1．磷酸盐缓冲溶液：将8.5g磷酸二氢钾（KH₂PO₄），21.75g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)，33.4g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)和1.7g氯化铵(NH₄Cl)溶于水中，稀释至1000mL。此溶液的pH应为7.2。

2．硫酸镁溶液：将22.5g硫酸镁 (MgSO₄·7H₂O) 溶于水中，稀释至1000mL。

3．氯化钙溶液：将 27.5g无水氯化钙溶于水，稀释至1000mL。

4．氯化铁溶液：将0.25g氯化铁(FeCl₃·6H₂O)溶于水，稀释至1000mL。

5．盐酸溶液(0.5mol/L):将40mL(ρ=1.18g/mL)盐酸溶于水中，稀释至100mL。

6．氢氧化钠溶液(0.5mol/L)：将20g氢氧化钠溶于水，稀释至1000mL。

7．亚硫酸钠溶液(c_1/2Na2SO3=0.025mol/L)：将1.575g亚硫酸钠溶于水，稀释至1000mL。此溶液不稳定，需每天配制。

8．葡萄糖-谷氨酸标准溶液：将葡萄糖(C₆H₁₂O₆)和谷氨酸(HOOC－CH₂－CH₂－CHNH₂－COOH)在103℃干燥1h，各称取150mg溶于水中，移入1000mL容量瓶内并稀释至标线,混合均匀。此标准溶液临用前配制。

9．稀释水：在5—20L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将此水暴气2—8h，使水中的溶解氧接近于饱和，也可以鼓入适量纯氧。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20℃培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8mg/L左右。临用前于每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1mL，并混合均匀。

稀释水的PH值应为7.2，其BOD₅应小于0.2mg/L。

10．接种液：根据所取水样用不同的方法获取适用的接种液。

11．接种稀释水：取适量接种液，加于稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量生活污水为1—10mL，表层土壤浸出液为20—30mL；河水、湖水为10—100mL。

接种稀释水的pH值应为7.2，BOD₅值以在0.3—1.0mg/L之间为宜。接种稀释水配制后应立即使用。

四、测定步骤

1．水样的预处理

（1）水样的pH值若超出6.5—7.5范围时，可用盐酸或氢氧化钠稀溶液调节至近于7，但用量不要超过水样体积的0.5%。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的碱或酸液进行中和。

(2)水样中含有铜、铅、锌、镉、铬、砷、氰等有毒物质时，可使用经驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释，或增大稀释倍数，以减小毒物的浓度。

(3)含有少量游离氯的水样，一般放置1—2h，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液，以除去之。其加入量的计算方法是：取中和好的水样100mL，加入1+1乙酸10mL，10%（m/V）碘化钾溶液1mL,混匀。以淀粉溶液作指示剂，用亚硫酸钠标准溶液滴定游离碘。根据亚硫酸钠标准溶液消耗的体积及其浓度，计算水样中所需加亚硫酸钠溶液的量。

(4)从水温较低的水域中采集的水样，可遇到含有过饱和溶解氧，此时应将水样迅速升温至20℃左右，充分振摇，以赶出过饱和的溶解氧。

从水温较高的水域或废水排放口取得的水样，则应迅速使其冷却至20℃左右，并充分振摇，使与空气中氧分压接近平衡。

2．水样的测定

（1）不经稀释水样的测定：溶解氧含量较高、有机物含量较少的地面水，可不经稀释，而直接以虹吸法将约20℃的混匀水样转移至两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使其产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样，加塞水封。

立即测定其中一瓶溶解氧。将另一瓶放入培养箱中，在20±1℃培养5d后。测其溶解氧。

（2）需经稀释水样的测定

稀释倍数的确定：地面水可由测得的高锰酸盐指数乘以适当的系数求出稀释倍数（见下表）。

工业废水可由重铬酸钾法测得的COD值确定。通常需作三个稀释比，即使用稀释水时，由COD值分别乘以系数0.075、0.15、0.225，即获得三个稀释倍数；使用接种稀释水时，则分别乘以0.075、0.15和0.25，获得三个稀释倍数。

稀释倍数确定后按下法之一测定水样。

①一般稀释法：按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1000mL量筒中，加入需要量的均匀水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至800mL，用带胶板的玻璃棒小心上下搅匀。搅拌时勿 使搅棒的胶板露出水面，防止产生气泡。

按不经稀释水样的测定步骤，进行装瓶，测定当天溶解氧和培养5d后的溶解氧含量。

另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白，分别测定5d前、后的溶解氧含量。

②直接稀释法：直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同（其差小于1mL）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水（或接种稀释水），再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量，然后引入稀释水（或接种稀释水）至刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。其余操作与上述稀释法相同。

在BOD₅测定中，一般采用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其它测定法。溶解氧的测定法附后。

五、计算

1．不经稀释直接培养的水样

BOD₅(mg/L)=c₁－c₂

式中：c₁——水样在培养前的溶解氧浓度(mg/L);

c₂——水样经5d培养后，剩余溶解氧浓度(mg/L);

2．经稀释后培养的水样                           

BOD₅(mg/L)=  ( (c₁–c₂)–(B₁–B₂)f₁)/f₂                   

式中：B1——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧浓度(mg/L);

B2——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧浓度(mg/L);

f₁——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；

f₂——水样在培养液中所占比例。

注意事项

1．测定一般水样的BOD₅时，硝化作用很不明显或根本不发生。但对于生物处理池出水，则含有大量硝化细菌。因此，在测定BOD₅时也包括了部分含氮化合物的需氧量。对于这种水样，如只需测定有机物的需氧量，应加入硝化抑制剂，如丙烯基硫脲（ATU,C₄H₈N₂S）等。

2．在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效，计算结果时，应取平均值。

3．为检查稀释水和接种液的质量，以及化验人员的操作技术，可将20mL葡萄糖-谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1000mL，测其BOD₅，其结果应在180—230mg/L之间。否则，应检查接种液、稀释水或操作技术是否存在问题。

附：碘量法测定水中溶解氧

一、原理

水样中加入硫酸锰和碱性碘化钾，水中溶解氧将低价锰氧化成高价锰，生成四价锰的氢氧化物棕色沉淀。加酸后，氢氧化物沉淀溶解，并与碘离子反应而释放出游离碘。以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定释放出的碘，据滴定溶液消耗量计算溶解氧含量。

二、试剂

1．硫酸锰溶液：称取480g硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）溶于水，用水稀释至1000mL。此溶液加至酸化过的碘化钾溶液中，遇淀粉不得产生蓝色。

2．碱性碘化钾溶液：称取500g氢氧化钠溶解于300—400mL水中；另称取150g碘化钾溶于200mL水中，待氢氧化钠溶液冷却后，将两溶液合并，混匀，用水稀释至1000mL。如有沉淀，则放置过夜后，倾出上层清液，贮于棕色瓶中，用橡皮塞塞紧，避光保存。此溶液酸化后，遇淀粉应不呈蓝色。

3．1+5硫酸溶液。

4．1%（m/V）淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，用少量水调成糊状，再用刚煮沸的水稀释至100mL。冷却后，加入0.1g水杨酸或0.4g氯化锌防腐。

5．0.02500mol/L(c_1/6K2Cr2O7)重铬酸钾标准溶液：称取于105—110℃烘干2h，并冷却的重铬酸钾1.2258g，溶于水，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。

6．硫代硫酸钠溶液：称取6.2g硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃·5H₂O)溶于煮沸放冷的水中，加入0.2g碳酸钠，用水稀释至1000mL，贮于棕色瓶中，使用前用0.02500mol/L重铬酸钾标准溶液标定。

7．硫酸（ρ=1.84g/cm³）

三、测定步骤

1．溶解氧的固定：用吸液管插入溶解氧瓶的液面下，加入1mL硫酸锰溶液，2mL碱性碘化钾溶液，盖好瓶塞，颠倒混合数次，静置。一般在取样现场固定。

2．打开瓶塞，立即用吸管插入液面下加入2.0mL硫酸。盖好瓶塞，颠倒混合摇匀，至沉淀物全部溶解，放于暗处静置5min。

3．吸取100mL上述溶液于250mL锥形瓶中，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入1mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好退去，记录硫代硫酸钠溶液用量。

四、计算

 溶解氧(O₂,mg/L)=M·V×8×1000/100

式中：M——硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L);

V——滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液体积(mL)。

注意事项

1．当水样中含有亚硝酸盐时会干扰测定，可加入叠氮化钠使水中的亚硝酸盐分解而消除干扰。其加入方法是预先将叠氮化钠加入碱性碘化钾溶液中。

2．如水样中含Fe³⁺达100—200mg/L时，可加入1mL 40%氟化钾溶液消除干扰。

3．如水样中含氧化性物质（如游离氯等），应预先加入相当量的硫代硫酸钠去除。