一、原理
利用氨基酸的两性作用，加人甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性。用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。

二、试剂
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的三级水。
甲醛(36%~38%):应不含有聚合物(没有沉淀且溶液不分层)。
酚酞。
乙醇。
邻苯二甲酸氢钾:基准物质。

三、试剂配制
氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)-0.050mol/L]:经国家认证并授子标准物质证书的标准滴定溶液或配制方法如下：
1、酚酞指示液:称取酚酞1g溶于95%的乙醇中,用95%乙醇稀释至100 mL。
2、氢氧化钠溶液[氯氧化钠标准滴定溶液c(NaOH)=0.05mol/L]：称取110g氢氧化钠于250mL的烧杯中，加100mL的水，振摇使之溶解成饱和溶液，冷却后置于聚乙烯的塑料瓶中,密塞放置，澄清后备用。取上层清液2.7 mL加适量新煮沸过的冷蒸馏水至1000mL,摇匀。
3、氢氧化钠标准滴定溶液的标定：准确称取约0.36g在105℃~110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾,加80mL新煮沸过的水,使之尽量溶解,加2滴酚酞指示液(10g/L),用氢氧化钠溶液滴定至溶液呈微红色,30s不褪色。记下耗用氢氧化钠溶液毫升数。同时做空白试验。
C＝m/( V1— V2)×0.2042………（1）
式中：
c-氢氧化钠标准滴定溶液的实际浓度。单位为摩尔每升(mol/L)；
m-基准邻苯二甲酸氢钾的质量。单位为克(g)；
V1-氯氧化钠标准溶液的用量体积。单位为毫升(mL)；
V2-空白实验中氢氧化钠标准溶液的用量体积。单位为毫升(mL)；
0.2042--与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液[e(NaOH)=1.000mol/L]相当的基准邻苯二甲酸氢钾的质量。单位为克(g)。
四、仪器和设备
酸度计(附磁力搅拌器)。
10mL微量碱式滴定管。
分析天平:感量0.1mg。

五、分析步骤
1、酱油试样
称量5.0g试样于50mL的烧杯中,用水分数次洗入100mL容量瓶中,加水至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200ml烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度计指示pH为8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总酸含量。加入10.0mL甲醛溶液,混匀。再用氯氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时取80ml水。先用氢氧化钠标准溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]调节至pH为8.2，再加人10.0mL甲醛溶液.用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH为9.2，做试剂空白试验。
2、酱及黄豆酱样品
将酱或黄豆酱样品搅拌均匀后，放入研钵中，在10min内迅速研磨至无肉眼可见颗粒,装人磨口瓶中备用。用已知重量的称量瓶称取搅拌均匀的样品5.0g用50mL80℃左右的燕馏水分数次洗入100mL烧杯中，冷却后，转人100mL容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯洗液并入容量瓶中并加水至刻度混匀后过能。吸取滤液10.0mL置于200mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度计指示pH为8.2记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数,可计算总酸含量。加人10.0mL甲醛溶液混匀。再用氣氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH为9.2记下消耗氯氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时取80mL水，先用氢氧化钠标准溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]调节至pH为8.2再加入10.0mL甲醛溶液,用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH为9.2做试剂空白试验。

六、分析结果的表述
试样中氨基酸态氨的含量按式(2)进行计算:
             X＝(V1— V2)×C×0.014×100/ m× V3/ V4………(2)
式中:
X一 试样中氨基酸态氮的含量,单位为克每百克(g/100g)；
V1一测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氯氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V2-试剂空白实验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,单位为毫升(mL)；
C-氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,单位为摩尔每升(mol/L)；
0.014--与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液[<(NaOH)=1.000mol/L]相当的氮的质量，单位为克(g)；
m-称取试样的质量,单位为克(g)；
V3一试样稀释液的取用量,单位为毫升(mL)；
V4一试样稀释液的定容体积.单位为毫升(mL)；
100一单位换算系数。
计算结果保留两位有效数字。

七、精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

B.第二法、比色法   

一、原理
在pH为4.8的乙酸钠乙酸缓冲液中，氨基酸态氣与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3.5-二乙酸-2.6-二甲基-1.4二氢化吡啶氨基酸衍生物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。

二、试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。
试剂：
乙酸:无水乙酸钠或乙酸钠。
甲醇。
乙酰丙酮。

三、试剂配制
乙酸溶液(1mol/L)：量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL。
乙酸钠溶液(1mol/L)：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠。加水溶解后并稀释至500mL。
乙酸钠乙酸缓冲液：量取60mL乙酸钠溶液(1mol/L)与40mL乙酸溶液(1mol/L)混合,该溶液pH为4.8。
显色剂:15mL37%甲醇与7.8mL乙酰丙酮混合,加水稀释至100mL,剧烈振摇混匀(室温下放置稳定3d)。

四、标准溶液配制
氨氮标准储备溶液(1.0mg/mL)：精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g于小烧杯中，加水溶解后移至100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0mg氨氮(10℃下冰箱内贮存稳定1年以上)。
氨氮标准使用溶液(0.1g/L):用移液管精确量取10mL。氨氮标准储备液(1.0 mg/mL)于100mL容量瓶内。加水稀释至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于100μg氨氮(10℃下冰箱内贮存稳定1个月)。

五、仪器和设备
分光光度计。
电热恒温水浴锅(100℃士0.5℃)。
10mL具塞玻璃比色管。

六、分析步骤
1、试样前处理
称量1.00g试样于50mL容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀。
2、标准曲线的制作
精密吸取氨氮标准使用溶液0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL分别于10 mL比色管中。向各比色管分别加人4mL乙酸钠乙酸缓冲溶液(pH4.8)及4mL显色剂，用水稀释至刻度,混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min，取出，水浴冷却至室温后。移入1cm比色阻内，以零管为参比,于波长400nm处测量吸光度。绘制标准曲线或计算直线回归方程。
3、试样的测定
精密吸取2 mL试样稀释溶液于10 mL比色管中。加入4 mL乙酸钠乙酸缓冲溶液(pH4.8)及4 mL显色剂,用水稀释至刻度,混匀。置于100℃水浴中加热15 min.取出,水浴冷却至室温后,移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度。试样吸光度与标准曲线比较定量或代人标准回归方程.计算试样含量。

七、分析结果的表述
试样中氨基酸态氮的含量按式进行计算:
                 X＝m×100/ m1×1000×1000× V1/ V2………(3)
式中:
X一试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每百克(g/100 g)；
m-试样测定液中氮的质量，单位为微克(μg)；
m1-称取试样的质量，单位为克(g)；
V1一测定用试样溶液体积，单位为毫升(mL)；
V2-试样前处理中的定容体积，单位为毫升(mL)；

八、精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

九、其他
本方法的检出限为0.0070 mg/100 g。定量限为0.0210 mg/100g。
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