维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。

维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有

（1）2，6-二氯靛酚法  （还原型V_C）

（2）2，4-二硝基苯肼法  （总V_C）

（3）碘酸法

（4）碘量法

（5）荧光分光光度法

一、2，6-二氯靛酚滴定法

1、原理：

还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型

抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样

品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

2、试剂

⑴ 1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000ml；

⑵ 2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000ml；

⑶ 维生素C标准液：准确称20mgV_C溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgV_C；

⑷ 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。

标定一：吸标液（V_C）5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001N KIO₃标液滴定到淡兰色。

计算：

抗坏血酸浓度（mg/ml）= （V₁ × 0.088）/ V₂

V₁ - 滴定时消耗0.001N KIO₃标液的体积（ml）

V₂ -维生素C重量（g）

0.088 -1ml0.001N KIO₃标液≈维生素C的量（mg/ml）

标定二：吸5ml已知浓度V _C标液 → 加5ml1%草酸 → 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点

计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T）

T= （C × V₁）/  V₂

C - 维生素C的浓度（mg/ml）

V₁ -维生素C的体积（ml）

V₂ -消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml）

⑸ 0.001N KIO₃标液：吸0.1N KIO₃溶液5ml→于500ml容量瓶内→加水至刻度，每毫升相当于V_C0.008mg；

⑹ 0.5%淀粉溶液；

⑺ 6%KI溶液；

3、操作方法

⑴ 提取：称样50g→加2%草酸100ml→到入捣碎机中→处理→过滤→颜色若深可加白陶土

⑵ 滴定：吸5ml样液→于三角瓶→用染料滴定至粉红色→15秒内不褪色

计算：

V_C（mg/100g）=（V × T）/ W   × 100

V -消耗染料体积（ml）

T -1ml染料所能氧化维生素C的毫克数

W- 滴定时所有滤液中含有样品的克数

4、注意事项

⑴ 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；

⑵ 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；

⑶ 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C；

⑷ 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe²⁺），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；

⑸ 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；

⑹ 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；

⑺ 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。

二、2，4-二硝基苯肼法

可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总V_C。

1、原理：

用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮古乐糖酸。

二酮古乐糖酸与2，4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正

比，可以比色定量。

2、步骤

⑴ 样品处理与分析

称一定样 → 加等量2%草酸 → 于高速捣碎机捣碎 → 取匀浆20g → 用1%草酸定容100ml → 过滤 → 取滤液10ml → 加1%草酸10ml → 加少量活性炭 → 摇1分钟 → 静置过滤 → 各取滤液2ml于样品管和样品空白管 → 各管加入1滴硫脲溶液 → 于样品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml → 分别于两个管加盖 → 于37℃保温箱3小时 → 取出后样品管放入冰水中 → 样品空白管取出后冷至室温 → 在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼 → 0.5ml → 样品管和空白管都于冰浴中 → 滴加85%H₂SO₄2ml于各管中 → 边滴边摇 → 防止温度升高炭化后呈黑色 → 冰浴中30分钟后取出 → 室温下放置30分钟后，在540nm测消光值，从标准曲线上查出相应的含量

⑵ 标准曲线的绘制

取5个50ml容量瓶编号  1     2     3     4     5

加V_C标液0.2mg/ml     10    20    30    40    50ml

取5个比色管取相应     2     2     2     2     2

加硫脲溶液（滴）       1     1     1     1     1

2，4-二硝基苯肼（ml）0.5   0.5    0.5   0.5    0.5     

于37℃保温箱3～4小时，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5ml→取出放30分钟→在540nm下测各消光值绘标准曲线，同时做空白。

计算：每百克食品中抗坏血酸的毫克数=C/W *100