昆明石杉HuperziakunmingensisChing.系石杉科石杉属植物，为我国特有种，主要分布于云南、贵州等地，生于灌木下、苔藓丛中[1]。20世纪80年代，我国科学工作者从同属植物蛇足石杉中分离到石杉碱甲(Hup-A)，并阐明它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗重症肌无力、记忆力减退和早老年痴呆具有较好的效果[2，3]，现已被广泛应用于临床。为了科学、合理地利用石杉属植物资源，本实验首次采用HPLC法对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定，为寻找和筛选石杉碱甲新的植物资源提供科学依据。

 

 

Aigent1100型HPLC色谱仪(带四元泵，自动进样器，紫外检测器等);电子分析天平(日本岛津);KQ50B超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(上海医疗器械厂);石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401);乙腈(色谱纯);二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。

 

实验药材采至贵州黔东南，由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉H.kunmingensisChing.，标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所，标本凭证(20056)。

 

 

2.1色谱条件ZORBAXSB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)，检测波长为310nm，流速1ml·min-1，柱温25℃，进样量为5μl。在此色谱条件下，样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离，其理论塔板数为4656，对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15min，对照品与样品的色谱图见图1。

 

2.2样品的制备

 

精密称取实验药材细粉2g于500ml的圆底烧瓶中，每次加入200ml石油醚提取3次，弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次，合并滤液并回收溶剂，加入2%的酒石酸溶解，用氨水调节pH值至8.0，再用氯仿萃取至Dragendorffors反应呈阴性，挥干有机溶剂，用无水乙醇溶解并定容至25ml即得。

 

2.3线性关系的考察

 

精密称取石杉碱甲对照品2.40mg于25ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容，得浓度为0.096mg·ml-1对照品溶液，再分别稀释成0.096，0.048，0.024，0.012，0.006，0.003mg·ml-1的对照品供试液，在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回归，得方程：Y=6776.0151X1.0305，r=0.99995。可知石杉碱甲在0.015～0.48μg之间与峰面积呈良好线性关系。

 

2.4精密度实验取石杉碱甲对照溶液，在色谱条件下重复进样6次，结果石杉碱甲峰面积的RSD为0.36%(n=6)。

 

2.5稳定性实验取供试品溶液，每隔2h测定1次，考察石杉碱甲的含量变化，结果含量的RSD为0.85%(n=6)，表明供试品在10h内稳定。

 

2.6重复性实验精密称样品6份，按“2.2”项的要求制备6份供试液，在色谱条件下分别进行测定，结果Hup-A含量的RSD为0.60%(n=6)。

 

2.7回收率实验精密称取昆明石杉药材细粉6份，每份1g，分别加入对照品供试液(0.003mg·ml-1)100ml，按样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试液进行测定，计算回收率(见表1)。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%，RSD=0.56%(n=6)。表1石杉碱甲加样回收率实验结果(略)

 

2.8样品的测定

 

按“2.2”项的要求精密称取样品3份，制备供试液，按色谱条件进行测定，重复3次，取平均值，石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。

 

 

首次采用HPLC法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。

 

测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定[4，5]方法的基础上，改用ZORBAXSB-C18色谱柱及以0.02mol·L-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)为流动相。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。

 

在同科属植物中，昆明石杉是石杉碱甲含量相对较高的一个植物品种，达到0.03%。