（一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法

（二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。

（三）实验器材

1.活材料：培养12-16h的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。

2.染色液和试剂：硝酸银染色液（见附二、（一）、8）、Leifson染色液（见附二、（一—）、9）、香柏油、二甲苯。

3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。

（四）实验方法

1.镀银法染色

（1）清洗玻片  选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。

（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1—2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。

用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。

（3）染色

①滴加A液，染4—6min。

②用蒸馏水充分洗净A液。

③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5—1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。

④用蒸馏水洗，自然干燥。

（4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。

结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。

2.改良Leifson染色法

（1）清洗玻片法同1。

（2）配制染料  见附录二（一）9。染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好。

（3）菌液的制备及涂片

①菌液的制备同1。

②用记号笔在洁净的玻片上划分3—4个相等的区域。

③放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。

④干燥  在空气中自然干燥。

（4）染色

①加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。

②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。

③干燥：自然干燥。

（5）镜检  先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。

结果：菌体和鞭毛均染成红色。

（五）实验作业：给出鞭毛菌的形态图

（六）注意事项

1.镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。

2.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。

3.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。

4.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。

附：细菌的运动性观察

（一）实验原理  细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。

悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。

大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。

（二）实验器材

1.活材料：培养12-16h小时的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）。

2.试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。

3.器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。

（三）实验方法：

1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。

2.涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。

3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。

4.盖凹玻片  将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。

若制水封片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。

5.镜检  先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。

结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。

（四）实验作业：绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。

（五）注意事项

1.检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。

2.制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。

3.若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一滴。