从上述要求中可以直观的看出,不同色谱技术对于分离度的要求不尽相同,至于个中缘由我们暂不揣度。只是有一点很重要:分离度不是指导原则等文件规定死的一个参数,正如大多技术参数一样,始终是为了满足使用目的而进行的“私人订制”,量后裁!
一、什么是基线分离?
但是,理论指导实践,实践是检验真理的唯一标准。比如说,上面对于基线分离的描述情形,在实际工作中基本不可能,而且说“基本”是为了满足“一切皆有可能”的严谨,否则可以直接说“根本不可能”。因为德国哲学家莱布尼茨说,世界上没有完全相同的两片树叶,而每一个色谱工作者都可以说,世上没有完全相同的两个色谱峰。
既然如此,那我们就不要再执念于分离度1.5了,也不要自欺欺人的出具一个显示分离度大于1.5的色谱报告而不看实际分离效果了。
二、分离度如何定?
仿制药或者改良型新药,甚至创新药!99.9%的核心技术思想离不开模仿、借鉴,还有0.1%留给那些从0到1的“传说”。同样的,我们这个问题,不妨看看别人家的孩子是如何优秀解决的。
下表1列举了从中国药典以及欧洲药典中随机摘录了一些典型的实例,对于分离要求可以说是“五花八门”。当然,这里对于具体品种为何制定了当前的分离要求,以及做了哪些研究,我们暂不做深究,也确实有心无力,无从下手,仅仅从表象来看个热闹。
如果说中国药典中的例子还算中规中矩的拓宽了我们对分离度1.5的认识,那欧洲药典分离度3.3、1.7、1.1是什么操作?这种有零儿有整儿的分离度是怎么搞出来的儿?峰谷比又是什么操作,跟分离度有什么区别,我该怎么选?看完以后什么感觉?眼花缭乱,再加上点眩晕,有点上头!
带着一脑门儿的问号,总感觉,法典里透着点草率,严谨中不失那么点随意。要不是看在欧洲药典的面子上,领导不得骂的你找不着北?
能!大写的。
而且,在这个彰显个性,鼓励创新的时代里,建议不要做分离度1.1、3.3这种纯仿制,也不要假模假式的做一些分离度1.2、3.4这种me-too,可以尝试做一些分离度2.2、4.4这种me-better,或者大胆一点做一些分离度1.03、2.21这种四不像。
三、如何证明合理性?
实际工作中也接触到不少人有这个想法:当分离度连中国药典那除另有规定外的1.5都达不到时,开始动了定分离度1.0、1.2的心思。但往往只是大笔一挥而已!比如,方法开发及方法验证时实际分离度为1.4,为了日后方法系统适用性通过性的保险起见,怀着一丝的忐忑,带着欧洲药典的一丝安慰,标准制定时写下了1.2,大胆一点的直接来个1.0。
当然,不仅是达不到分离度1.5时的退让,更有很多达到1.5后的前进,比如分离度应大于10.0。这些数值的制定不仅仅是一个耐用性的探索,更不是冒险或保守之类的估计,而是需要具体的试验设计去验证。
根据以上信息,我们可以推断的是,实际分离效果肯定不止1.1,这只是一个最低可接受限度。因此在正常色谱条件下对方法进行完整验证后,针对希望拟定的分离度再次进行试验设计以验证合理性。
1、拟定分析方法耐用性的关键参数:碳酸铵溶液浓度、流速、柱温、色谱柱及仪器。
2、拟定关键耐用性参数在日常检测中可能出现的偏离,比如碳酸铵溶液浓度由于配制过程导致的误差,由于仪器本身性能导致的流速及柱温控制差异,色谱柱批次间的差异,不同仪器(型号、品牌)之间的差异。这些差异均可以根据经验及相关的性能确认(PQ)进行预先估计,在估计的基础上适当放宽考察。
3、在上述各种拟定的偏离条件下进行分离度考察,确定最差分离度,比如说是在流速2.2ml/min时分离度为最差的1.1。
4、在流速2.2ml/min,分离度为1.1的条件下,设计杂质A与杂质B的灵敏度(检测限、定量限),线性与范围,准确度(加标回收)试验。此时,我们甚至可以在该条件下兼顾其他杂质的再次验证。
5、在最差分离度条件下,各项验证均满足拟定的验证要求时(不一定非得完全按照中国药典9101的要求),可以合理的制定所希望的分离度或峰谷比。
此外,尚需说明一点的是,耐用性不是通过性验证,无需拟定范围后追求耐用性试验的通过。耐用性的参数应在方法开发阶段已完成边界的探索,并进行了初步的验证;在方法学验证阶段根据开发时的边界,适当调整符合实际使用场景的参数偏离范围并进一步的确认。