如果色谱图上出现的是双峰：

（1）首先就会推测样品可能含有两个或以上的化合物。

（2）如果确保进样的是化学纯的单一物质，应当考虑是否是光学纯的问题，即可能存在手性异构体，这就需采用手性色谱柱进行分析；此外，还需考虑是不是样品不稳定的原因，在该分析条件下迅速降解成两个或以上的化合物。前面两种情况很好解决，毕竟是两个不同的化合物，更换色谱柱、调整分析条件就能将其分开。

（3）如果确保进样的是光学纯的单一物质，且该结构在此色谱条件中稳定，仍然出现了双峰，通常被称为色谱双峰，也就是单一物质在色谱图中出现双峰的现象。这种情况非常容易误导分析者的判断，那么色谱双峰该如何判别区分？是什么原因产生，又该如何解决呢？可以从以下几方面思考色谱双峰的产生的原因。

色谱柱或保护柱污染或塌陷
01

这是遇到色谱双峰首先考虑的方面，如果你分析样品时发现每个色谱峰都出现双峰（出峰越快，出现双峰的可能性越少），尤其采用单一纯物质时，可以判定色谱柱出问题（柱头受损或柱头固定相变脏或流失）。如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头端堵塞，将色谱柱反接冲洗维护，一般情况下可以解决。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头填料受污染或键合相流失可能性更大，这时可以对色谱柱维修处理或者使用新的色谱柱，维修建议交由厂家处理。

解决方案：将保护柱拿掉，检测色谱双峰是否有改善。如果没有使用保护柱，那就是色谱柱污染或者堵塞（可以通过压力判断），最好的方法是将色谱柱反过来接，用流动相或其它溶剂冲洗、酸洗，将堵在柱头的残留物冲掉，一般情况下可以解决色谱双峰问题。如果依旧不行，那就是强吸附物质污染了色谱柱，则有必要采取色谱柱再生的方法。

溶剂效应
02

这是双峰产生的一个很重要的原因，即样品溶剂与流动相的相容性不好，导致单一物质出现色谱双峰。例如当以中等极性的溶剂作为进样溶剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而流动相体系中以强极性水为主，样品进样体积较大时，很可能出现色谱双峰现象。主要是由于样品溶剂与流动相极性相差太大，流动相来不及将进样溶剂稀释，从而引起色谱柱内的环境突然发生较大的变化（即极性不均匀），造成组分洗脱不均匀，导致色谱峰裂分或分叉。对极性比较敏感的化合物容易产生此种情况，通常表现在出峰时间较早的色谱峰裂分，对较晚的色谱峰影响较小，且第二峰比第一峰小，常伴有拖尾。

解决方案：调整样品的进样溶剂，尽可能与流动相溶剂保持一致；此外，减小样品的进样体积，亦可以减少色谱双峰的发生。

进样量过载
03

通常表现为双峰紧靠在一起，基本上齐高不拖尾。主要是由于样品进样浓度很高或进样体积很大，色谱柱过载，从而出现色谱双峰。如果降低进样量将样品稀释后再进样，色谱双峰基本就可以改善。

解决方案：将样品稀释，同时减少进样体积。

流动相的酸碱度
04

这种情况主要针对弱酸碱性化合物而言。流动相中酸碱pH值不仅与峰拖尾相关，同时也可能出现色谱双峰。通常是第二峰比第一峰小，当出峰时间较早时，两峰高差距较大，第二峰较小，甚至消失；当出峰时间较长时，峰高趋于相等。主要可能是样品在流动相中存在酸碱解离平衡，化合物同时存在已解离和未解离两种分子状态。我们曾采用HPLC制备分离过一类胆汁酸类成分，流动相中加入0.01%甲酸，虽色谱峰不拖尾，但几乎每个胆汁酸类色谱峰裂分成双峰。当提高流动相中甲酸的浓度至0.05%和0.1%，可以明显看到胆汁酸色谱峰的裂分距离缩小，明显的由色谱双峰向单峰融合。

解决方案：改变流动相中酸碱的pH值，提高酸碱的浓度，在更强的酸碱性条件进行分析。

样品的互变异构
05

如果某一物质出现双峰，两峰紧靠且不拖尾，条件稍加变化，如pH、温度改变，双峰消失或减小，例如红霉素等。有的样品采用LC/MS分析时，紫外色谱图虽不易观察到双峰，但质谱总离子流图出现较为明显的色谱双峰。这可能与特定的物质有关，由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在，如酮式和烯醇式互变。

解决方案：了解样品性质，调整色谱方法，如改变流动相或进样溶剂中pH值、缓冲盐，降低或升高柱温箱的温度等，以减少互变异构的发生，促使样品在分析条件中主要以单一构型为主。

仪器参数设置不合理
06

参比波长设置错误，例如设置分析波长254nm，参比波长400nm，这个对于大多数化合物可能没影响。但是如果被测化合物，在400nm处也有强的紫外吸收，比254nm更强。这样其出峰时，由于背景的抵扣作用，本来一个峰会变成对称的二个峰，而且如果将二峰之间的峰谷反转180度，恰好是一个完整的峰。这时要将参比波长设置更大，或者取消。