聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分离,最常用于蛋白质的分离,这里总结了DNA电泳的各种浓度PAGE胶配制的配方及制备方法。
聚丙烯酰胺 凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。
各种浓度PAGE胶的配制(DNA电泳用)
50ml体系:
丙烯酰胺 |
有效分离(bp) |
二甲苯青 |
溴酚蓝 |
丙烯酰胺30%(ml) |
10×TBE(ml) |
ddH2O(ml) |
TEMED(µl) |
过硫酸铵10%(µl) |
3.5% |
100-1000 |
460 |
100 |
5.83 |
5 |
39.17 |
25.0 |
250 |
5.0% |
100-500 |
260 |
65 |
8.33 |
5 |
36.67 |
25.0 |
250 |
8.0% |
60-400 |
160 |
45 |
13.33 |
5 |
31.67 |
25.0 |
250 |
12.0% |
40-200 |
70 |
20 |
20.0 |
5 |
25.00 |
25.0 |
250 |
15.0% |
25-150 |
60 |
15 |
25.0 |
5 |
20.00 |
25.0 |
250 |
20.0% |
5-100 |
45 |
12 |
33.33 |
5 |
11.67 |
25.0 |
250 |
5ml体系:
丙烯酰胺 |
丙烯酰胺30% |
10×TBE |
ddH2O |
TEMED |
过硫酸铵10% |
3.5% |
0.583 |
0.5 |
3.917 |
2.5 |
25 |
5.0% |
0.833 |
0.5 |
3.667 |
2.5 |
25 |
8.0% |
1.333 |
0.5 |
3.167 |
2.5 |
25 |
12.0% |
2.00 |
0.5 |
2.5 |
2.5 |
25 |
15.0% |
2.50 |
0.5 |
2.0 |
2.5 |
25 |
20.0% |
3.333 |
0.5 |
1.167 |
2.5 |
25 |
1、丙烯酰胺30%为29:1(质量比,丙烯酰胺:双甲叉丙烯酰胺)
2、TEMED 可以加到1ul/ml。
不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
丙烯酰胺(%) |
有效分离范围(bp) |
溴酚兰* |
二甲苯青* |
3.5 |
100~2000 |
100 |
460 |
5.0 |
80~500 |
65 |
260 |
8.0 |
60~400 |
45 |
160 |
12.0 |
40~200 |
30 |
70 |
15.0 |
25~150 |
15 |
60 |
20.0 |
10~100 |
12 |
45 |
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子 所含碱基对数目(bp).
凝胶的制备过程:
1、 按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60°。
3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
4、 加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。
5、 立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成10°角,可减少液体泄漏的机会。
6、 室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE缓冲液。
7、 小心取出梳子,加样。
大家可以根据自己试验中DNA片段大小的不同选择配制合适浓度的丙烯酰胺胶。PAGE胶配制过程中记得避免气泡的产生。