微生物的分离是指将目标菌种从微生物群体（尤其是不同微生物群体）中分离出来的技术，是微生物实验最基本的技术。微生物的分离培养方法主要有三种：划线分离法，涂布平板法和倾注平板法。后两种方法又可以同时进行计数，我们一起详细学习一下微生物分离纯化方法和技巧，微生物数量计数方法，一步步教你学习分离纯化技术，争取从实验室小白进军分离培养大师。利用接种环将目标菌种在固体培养基表面划线，菌种逐步稀释，培养后能够长出许多单一菌落，从而达到菌种分离纯化的目的。(4)蘸取菌种：甘油管用75%酒精消毒，待酒精挥发完全，在酒精灯火焰略微灭菌（防止烤糊），然后用接种环蘸取一环菌种；(5)划线：取已经备好的固体平板，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），用上述接种环在平板上划线，先在一侧连续划线3-4次，边转动平板边用酒精灯灼烧接种环，冷却后，用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次，同样方法进行第三次划线，或第四次划线（根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数），灼烧接种环；(6)标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；(1)甘油管菌种取出后，尽量不要放回去，或者标记清楚，反复冻融菌种效果不好。要烧红！要烧红！要烧红！重要的事情说三遍，不烧红灭菌不彻底，容易污染，也可能出不来单菌落。
(3)烧红的接种针一定要冷却后再使用，如何确定接种针是否冷却？用接种针沿着固体培养基内侧边缘或不可能用到的区域“轻点”，试一下固体培养基是否能够融化，如果融化，说明温度过高，继续冷却；如果不融化，说明接种针已经冷却，可以使用。(4)甘油管菌种的浓度直接影响到划线区域的分布，如何确定甘油管菌种浓度？第一种方法，事先查阅试验记录，确定甘油管菌种浓度。第二种方法，借助显微镜观察，粗略判断甘油管菌种浓度。但是，在实际操作中，很少人扫尾，因为有时候看不清尾部在哪，直接在附近区域划线，效果也不错。(6)一定要标记清楚菌种信息和划线日期，一般情况在培养皿底部边缘处标记。(1)除样品外，所有试验都必须在无菌环境下进行，在打扫卫生、实验室消毒过程中，一定要做好个人防护。(2)试验过程中，一定要正确使用酒精灯，避免着火。(4)试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。(6)试验过程中，避免手部接触平板边缘，以免造成污染。(7)试验过程中，如果出现意外，比如说着火，别着急，拿上湿抹布覆盖即可。
二、涂布平板法
待分离微生物样品经过一系列梯度（一般10倍递增）稀释后，使微生物菌体充分分散，成为单细胞，然后再取出一定量，涂布到固体培养基表面的方法，再经过适宜的培养条件，形成单菌落的过程。(2)获得纯培养在微生物杂菌中的数量或比例—平板计数。
(1)称量：准确称取待测样品1g或量取待测样品1mL。(2)稀释：将上述样品放入装有99mL无菌生理盐水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，记录。(3)摇匀：将上述三角瓶放置于摇床上振荡30min，使微生物细胞充分分散，静置20-30s，即成10-2稀释液。(4)继续稀释：再用1mL无菌移液器，吸取上述稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液和水混合均匀，即成10-3稀释液。(5)继续稀释：再换一支无菌移液器，吸取10-3稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，即成10-4稀释液。(6)继续稀释：以此类推，连续梯度稀释，制成10-7、10-8、10-9 等一系列稀释菌液。(1)标记：将事先制备好的无菌平板上标记10-7、10-8、10-9，每一个梯度稀释设置三个重复。(2)涂布：用无菌移液器分别吸取10-7稀释液0.1mL放入编号10-7的3个平板中，然后用涂布棒或涂布器将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个涂布器，用完涂布器酒精灯灼烧灭菌。(3)继续涂布：同样涂布10-8稀释液和10-9稀释液，切记更换涂布棒。(4)培养：将涂布好的平板平放于超净台上静置10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。
计数原则：
(1)计数原则，平板上菌落数30-300个为合格。(2)如果只有一个稀释度的平均菌落数，则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。(3)如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求，则按照两者菌落总数之比来决定，如果小于2，取两者的平均值如果大于2，取较小的菌落总数。(1)前几个稀释梯度，尤其是第一个梯度适当放大稀释倍数。这样不容易丢失目标菌，也可以很好地对样品进行溶解。
玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或颗粒性样品，可以将颗粒表面微生物与液体充分接触。这样不容易造成不同稀释度间混乱，防止不同梯度间取样不准。
平板涂布法的难点就在于稀释，稀释不准确后面一切都化为零，一定要摇匀再取样。
并不是每一个样品都需要稀释到10-9，而是要根据样品中微生物的数量进行稀释。静置有利于微生物在培养基表面吸附，直接倒置培养，可能倒置菌液向一侧流动。
(7)倒固体培养基的时候，可以适当吹干或提前一到两天倒平板。平板表面没有多余水分且比较湿润，涂布时候既容易涂开也不会造成出现菌苔。(1)注意涂布力度，大小适宜，不应划破培养基的表面。(4)试验完毕，注意灼烧涂布器，以免影响环境，造成交叉污染。
三、倾注平板法
1.定义：
待分离微生物样品经过一系列梯度（一般10倍递增）稀释后，使微生物菌体充分分散，成为单细胞，然后再取出一定量稀释液和固体培养基混匀，倾注到固体培养基的方法，再经过适宜的培养条件，形成单菌落的过程。
2.目的：
3.操作步骤：
梯度稀释步骤：同平板涂布法。
倾注平板步骤：
(1)制备培养基：准备固体培养基和培养皿，高压蒸汽灭菌锅灭菌后固体培养基放置于水浴锅中备用。
(2)标记：将事先制备好的无菌平板上标记10-7、10-8、10-9，每一个梯度稀释设置三个重复。
(3)倾注：将固体培养基冷却至适合温度后，用无菌移液器吸取10-7稀释液0.1mL放入固体培养基中混匀，然后倒入编号10-7的3个培养皿中，或者用无菌移液器吸取10-7稀释液0.1mL放入编号10-7的3个平板中，倒固体培养基，在培养皿中混匀。(4)继续倾注：同样倾注10-8稀释液和10-9稀释液。(5)培养：将倾注好的平板平放于超净台上静置，待凝固后，将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。
(6)计数：待长出单菌落后即可计数。
菌落计数：同平板稀释法。
4.操作技巧：
(1)固体培养基温度不宜过高，过高会烫死微生物；温度也不能太低，容易凝固结块，无法和稀释液混匀。如何确定合适的温度？
用手心手背触摸培养基，手心不烫手背烫的温度，基本就是50℃左右（不同人温度敏感性有一定差异）。
根据不同目标菌种，确定合适的温度，但一定要考虑固体培养基凝固的温度，一般40℃左右凝固。
(2)培养基和稀释液混匀过程中，沿壁摇匀，以免产生起泡，影响观察和美观。沿壁摇匀，能够保证培养基和稀释液充分混合，也不会产生气泡，切勿猛烈摇晃，气泡太多，制成的平板无法计数。
(3)梯度稀释过程，一般用试管，试管长度要适宜，不宜过长，不方便操作，也不宜过短，无法摇匀或容易溢出。
(4)为了操作方便，可以采用离心管代替试管进行梯度稀释，上下颠倒，容易混匀。(5)实验过程中用到的无菌水是无菌生理盐水，保护细胞。
5.注意事项：
(2)固体培养基放置在水浴锅中，也要经常摇动，不能静置。(5)试验完毕，注意灼烧涂布器，以免影响环境，造成交叉污染。
四、平板涂布法和倾注平板法的区别和联系
1.第一步都是先梯度稀释样品，稀释好后，分离方式不同。
平板涂布法是将不同梯度的稀释液分别取少量，加入不同的固体培养基上，然后用涂布棒在平板表面涂布均匀。
倾注平板法是将不同梯度的稀释液分别取少量，和融化好的培养基混匀后倒入培养皿中。
2.固体培养基的处理方式不同
平板涂布法是将固体培养基和培养皿灭菌后，培养基冷却至合适温度再倒平板，平板凝固后才可以使用，要么无法涂布。
倾注平板法是将固体培养基灭好后，放置在恒温水浴锅中，一直等到备好不同梯度稀释液后，固体培养基冷却至适合温度跟不同梯度稀释液混匀，然后倒入干净的培养皿中。
倾注平板法为了涂布均匀平整，有时候需要事先倒一点固体培养基在培养皿中，就是双层平板。
3.平板涂布法优势和劣势
(1)涂布技术不好，经常涂布不匀，无法计数。
(2)不需要控制固体培养基温度。
(3)可以将所有单菌落挑出来，保存，用于后续试验。
4.倾注平板法优势和劣势
(1)不需要涂布，省去了涂布不匀的麻烦。
(2)需要控制固体培养基温度。
(3)无法将所有单菌落挑出来。
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