一、实验目的

了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。

二、实验原理

    稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

三、实验器材   

    1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。

2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）

3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。

四、实验方法

    1．样品稀释液的制备  准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10^-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10^-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10^-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0^-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀释菌液（图22-1）。

图22-1  平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10^-7、10^-8、10^-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10^-4、10^-5、10^-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0^-3、10^-4、10^-5稀释度，测定真菌数量时，采用10^-2、10^-3、10^-4稀释度。

2．平板接种培养  平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。

    （1）混合平板培养法  将无菌平板编上10^-7、10^-8、10^-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10^-9稀释液各1ml放入编号10^-9的3个平板中，同法吸取10^-8稀释液各lml放入编号10^-8的3个平板中，再吸取10^-7稀释液各lml放入编号10^-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。

（2）涂抹平板计数法  涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。

五、实验作业：

  将实验结果填入下表中

计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。

    （1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。

    （2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。

选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。

混合平板计数法：

每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数

涂抹平板计效法：

    每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数