适用于食品中志贺氏菌的检验。

• 分液器

• 拍击式均质器

• 定量接种环

• 厌氧培养系统

• 生化鉴定系统

   

   

• 志贺氏菌增菌肉汤

• 麦康凯（MAC）琼脂

• 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂

• 三糖铁（TSI）琼脂

• 半固体琼脂

• 营养琼脂 

志贺氏菌检验流程

4.1 样品制备、增菌

以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10000 r/min均质；或加入装有225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质 器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于 41.5℃±℃，厌氧培养16h～20h。

4.2   分离

取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48 h 再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。

注：若在指定培养时间内，出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，可继续培养至48h再进行观察。

4.3 初步生化试验

1）分别在MAC琼脂平板和XLD琼脂平板上选取2个以上典型或可疑菌落；2）先用接种环挑取同一菌落，分别接种到TSI琼脂斜面、半固体琼脂和营养琼脂斜面，再用接种针在TSI琼脂斜面和半固体琼脂斜面上进行穿刺；3）标记清楚后置于36±1℃培养箱内，培养20～24h，观察结果。

观察TSI琼脂中斜面产碱、底层产酸、不产气、不产硫化氢，且半固体琼脂中无动力的菌株，挑取对应的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。

4.4 生化试验

用营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，包括β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化特性见表2。

4.5 附加生化实验

由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型） 菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺 氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36 ℃培养 24 h～48 h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D 菌的生化特性区别见表 3。

由于传统生化试验过程需要使用大量试剂，且还需保证有足够量的菌苔，因此有时可能需再次对可疑菌落进行扩繁。针对这些问题，目前常采用生化试剂盒或生化鉴定系统来完成这一步骤，以减少操作人员的工作量、降低工作难度，缩短检测周期。

4.6 血清学鉴定（选做项目）

凡疑为志贺氏菌，可挑取营养琼脂斜面上的培养物，做玻片凝集试验。

1）抗原准备：志贺氏菌属抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

2）血清凝集反应：在玻片上选取2块约1cmx2cm的区域，用接种环挑取一环待测菌分别放入选定区域内，往其中一块下部加1滴抗血清，另一区域下部加1滴生理盐水（对照），分别将菌落研成乳状液，将玻片倾斜摇动，使菌与抗体/生理盐水混合，1min后并对着黑色背景观察结果。

抗血清中出现凝结成块的顆粒，且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。