致病性弧菌及检测_常见致病微生物的检测_食品微生物检验技术_检验技术

一、致病性弧菌的流行病学

1、致病性

　　在众多的弧菌之中，致病性差距很大。O1型霍乱弧菌被WHO定为国际检疫菌，而同时有许多种和生物型根本不具致病性。

生物分类学上的霍乱弧菌有许多血清型致病性很弱、甚至不具致病性。

　　1995年《美国临床微生物手册》第六版明确了弧菌属的致病菌为12种，它们的名称及致病情况如下表所示：

表1. 致病性弧菌及所致疾病

弧菌种类	临床表现
	胃肠炎	创伤感染	耳感染	败血症
O1型霍乱弧菌 O139型霍乱弧菌拟态弧菌河弧菌副溶血性菌霍利斯性菌溶藻弧菌弗尼斯菌创伤弧菌麦契尼可夫弧菌海鱼弧菌辛辛那提菌鲨鱼弧菌	+++ +++ 　　　　++　　　　　　 +　　　　　　 + ++ 　　　　　　　　　　　　+ ++ +++　　　　　　　　　　　　　　　　　　　+ ++ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　+ （+）　　　++　　　　　　 ++　　　　　　+ （+）　　　++ 　　　　　　　　　　　　　++ （+）　　　++　　　　　　　　　　　　　 ++ （+）　　　　　　++　　　　　　　　　　　　　 + 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　+ 　　　　　　+

注：+++：常见；++：不常见；+：罕见；带括号者为肠道感染的病因作用尚未确定。

　　12种致病性弧菌的致病性差别较大，所致疾病的种类和毒性差别较大。在这12种致病菌中，最重要的，也是出问题最多的
是O1型霍乱弧菌、非O1型霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌。国内外均是如此。美国FDA在“食品微生物控制”中特别强调了这
四种菌，欧洲的NMKL也对这四种菌提出了特别要求，并有专门方法NMKL No.156颁布。

2、美国FDA对霍乱、副弧、创伤弧菌的认识（见表2）

3、致病性弧菌的控制

　　弧菌和其它G^-菌一样，是嗜温型菌，生长需较高的温度，高水活度，中性pH。与其它不一样的是，生长需要盐，故而十分耐盐，
但轻微热处理很易将其杀灭。

　　蒸煮控制，防止二次污染，防止时间/温度控制不当（注意冷藏），控制产品来源。

二、致病性弧菌的分类学位置和生物学性状

1、致病性弧菌的分类

　　根据伯杰氏细菌手册第九版的描述，12种致病性弧菌的分类学位置如下表所示：

第5部分革兰氏阴性兼性厌氧杆菌

弧菌科

弧菌属

致病性弧菌

　　伯杰氏细菌手册将细菌分为35部分（Group），第5部分为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，包括弧菌科、肠杆菌科、巴斯德氏菌科、
其他属，弧菌科包括弧菌属、发光杆菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属和Enhydrobacter属。

　　弧菌属共有37个种（变种），其中已明确有12个种对人类有致病作用。弧菌属的种除了霍乱弧菌和拟态弧菌之外均为海洋性细菌，
即有嗜盐性；即使是这两种菌， Nacl的存在也能促进生长。

2、致病性弧菌的生物学性状

（1）致病性弧菌的基本特征

　　根据分类学位置，致病性弧菌首先属于弧菌科，所以具备弧菌科的所有特性：革兰氏阴性、兼性厌氧，（弧）杆状。

　　作为弧菌属，可从下列特性与弧菌科的其他四个属区别开来：DNA、G+C、 MOL%:38-51、O/129敏感：+、脂酶：+、 D-甘露醇
发酵：+、端生存鞘鞭毛+（其它没有）

（2）致病性弧菌生理生化特性比较

　　除此之外，12种致病性弧菌各有其不同的生理生化特征（见表3），这些特征是检测和鉴定的依据和基础。

表2.FDA/CFSAN对弧菌的描述

菌名	定义	急性病名	病症	感染剂量	诊断	相关食品	发病率	目标人群	食品分析	宿主	染病类型
创伤弧菌	只感染人和灵长类动物，已从整个美国西海岸及内陆盐湖分出，包括水、沉积物、浮游生物、贝类	伤口感染、胃肠炎、原发性败血病	16小时内发病，健康人患胃肠炎，特殊生理状况的人患原发性败血病该病死亡率大于50%	健康人胃肠炎感染剂量不清，易感人群小于100个	从伤口腹泻物中培养出该菌	牡蛎、蛤蜊、蟹等	未有大爆发，零散的多，特别是在温暖月份	所有人易患胃肠炎，“特殊生理状况”的人易患原发性败血病	与粪便分离方法同，所有分离物均有致病性，	港湾水域	感染
副溶血性弧菌	可从海水和河口湾的水体、鱼类、贝类中分出	副溶血性弧菌相关的胃肠炎	腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐、头痛、发烧、畏寒，多为中等反应	大于100万，服解酸药的更低	从腹泻粪便中分离出该菌	鱼类、贝类	温暖月份发生过大爆发，单个病例时有发生	所有食用了生的或加工不当的鱼类和贝类的人	必须验证分离物的致病性	港湾水域	感染
霍乱弧菌O1型	亚洲多，沿海和河口湾可能有，个例报道时有发生	霍乱	脱水、伴有淘米水样便、腹部痉挛、呕吐、休克甚至死亡	100万，有抗酸性结核病的更低	从腹泻粪便中分离出该菌	贝类饮料各种食品	美国73年来仅有80例	所有人都有可能，免疫系统发育不全，胃酸少，营养不良的更甚	由于致病性的和非致病性的都存在，故需做霍乱毒素实验	污水、人	感染
霍乱弧菌非O1型	只感染人和灵长类动物，存在于美国海与河口湾，称非霍乱菌和非凝集霍乱菌	胃肠炎、非O1型霍乱	腹泻、腹部痉挛、发烧、25%的呕吐、大便带血和粘稠物	猜想是大剂量（大于100万）才能引起疫病	从腹泻粪便中分离出该菌	贝类特别是牡蛎、各类食品	未有大爆发，单个病例时有发生	所有食用的个体，但肝硬化和免疫抑制的个体可能引起严重并发症如败血症	很多为非致病性的，需做致病性实验，可用动物实验做	港湾水域	感染

表3 致病性弧菌的鉴别性状

TCBS

Nacl生长

42℃生长

产酸

氧化酶

ONPG

VP试验

精氨酸二氢酶

赖氨酸脱梭酶

鸟氨酸脱梭酶

129

150

明胶酶

脲酶

10%

蔗糖

D纤维二糖

乳糖

阿拉伯糖

D甘露糖

D甘露醇

溶藻弧菌

霍乱弧菌

辛辛那提弧菌

海鱼弧菌

河弧菌

弗尼斯弧菌

鲨鱼弧菌

霍利斯弧菌

麦氏弧菌

拟态弧菌

副溶血弧菌

创伤弧菌

嗜水气单胞菌

类志贺邻单胞

注：Y：黄色；G：绿色；P：紫色；NG：不生长；nd：不定；K：碱性；A：酸性；a：微酸；+：80%以上阳性；

-：80%以上阴性；V：不同的菌株反应不同；S：敏感；R：抗性

3、霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的部分生长和耐热参数

表4. 霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的部分生长和耐热参数

参数　菌名	生长参数						热致死参数
	最低温度	最高温度	最小 pH	最大 pH	最小 QW	最大含盐量	温度		D值	介质
	最低温度	最高温度	最小 pH	最大 pH	最小 QW	最大含盐量	UC	UF	D值	介质
霍乱弧菌	N/A	45℃	N/A	10	N/A	6	60	140	2.65	蟹肉
副溶血弧菌	5℃	44	4.5	11	0.937	10	49	122	1.15	盐溶液
创伤弧菌	10	N/A	4.5	N/A	N/A	8

三、致病性弧菌的检测方法

1、具有代表性检验方法简介

（1）、FDA的细菌学分析手册

　　霍乱、付弧、创伤弧菌和其他弧菌（1995 1998修订）分别着重介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的方法。

　　用PCR方法检测产肠毒素的霍乱弧菌叙述了霍乱肠毒素（cholera Toxin (T)基因

（2）、AOAC官方分析方法

　　牡蛎中的霍乱弧菌：升温富集法（1995.a）

　　创伤弧菌的脂肪酸气相色谱鉴定法（AOAC.1995.b）

　　美国midi公司生产的shelock微生物鉴定系统。

（3）、ISO方法

　　副溶血弧菌的检测方法（ISO8914：1990E）

（4）、NMKL

　　食品中致病性弧菌的检测和计数（NMKL N0156）介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的检测程序。

（5）、不同国家的方法

　　日本、瑞士等国均有相应检验方法。

2、致病性弧菌的检测方法

　　以上介绍的方法均是以单一或少数目标菌（NMKL为四种）为目的的设计的程序。鉴于国外对出口食品中多种致病性弧菌的要求和重视，
有必要探讨“同一程序同时检测多种弧菌”方法。

　　检验程序

　　25g样品+225mL APW(1% NacL pH9.0)

增菌 ↓37℃8-16h

取10mL加入双倍APW

↓37℃6-8h

选择选择培养基 TCBS

（霍利斯用非选择性的羊血球琼脂）

↓37℃24h

定弧菌取黄色或绿色菌落做G染色、氧化酶、动力、

↓ O/129(150ug)、D-甘露糖

分组初步鉴定：0% NacL , 1% NacL、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、（氧化酶）
分成5组

↓

确证最后鉴定

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