—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法

 

1 范围

     本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。

本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。

样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。

 

2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法

2.1 方法提要

    试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。

 

2.2 试剂和溶液

    除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯

2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

2.2.5 苯：色谱纯

2.2.6乙腈：色谱纯

2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

2.2.8氯化钠（NaCl）

2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）

2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）

GB/T 18979-2003

 

2.2.11氯化钾（KCl）

2.2.12  PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

2.2.13  吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。

2.2.14  pH7.0磷酸盐缓冲溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液与29.1mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液混匀后，稀释到100 mL。

2.2.15 黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2）：纯度≥99%。

2.2.16 黄曲霉毒素标准贮备溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分别配制0.100mg/mL的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准贮备液，保存于4ºC备用。

2.2.17 黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准贮备液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀释成混合标准工作液。

2.2.18 柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：称取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加纯水定容至200mL，以0.45μm的尼龙滤膜过滤，4℃避光保存。

 

2.3 仪器和设备

    实验室常规仪器、设备、材料及下列各项。

2.3.1 高速均质器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.2 黄曲霉毒素免疫亲和柱。

2.3.3 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。

2.3.4 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.5 玻璃试管：直径12 mm ，长75mm，无荧光特性。

2.3.6 高效液相色谱仪：具有360nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器。

2.3.7 空气压力泵。

2.3.8 微量注射器：100mL。

2.3.9 色谱柱：C18柱（柱长150 mm ，内径4.6mm，填料直径5mm）。

 

2.4 分析步骤

2.4.1提取

2.4.1.1大米、玉米、小麦、花生及其制品：准确称取经过磨细（粒度小于2mm）的试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及准确加入125.0mL（ ）甲醇-水（7+3），以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL（ ）滤液并加入30.0mL（ ）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

2.4.1.2 植物油脂：准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL（ ），以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL（ ）滤液并加入30.0mL（ ）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

2.4.1.3 酱油：称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加入2.5g氯化钠及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL（ ），以均质器高速搅拌提取1min。定量滤纸过滤，准确移取10.0mL（ ）滤液并加入40.0mL（ ）水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至滤液澄清，备用。

2.4.1.4 食醋：准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL（ ），混匀，定量滤纸过滤。取10.0mL（ ）滤液加入10.0mL（ ）缓冲液，混匀。以玻璃纤维滤纸过滤1~2 次，至滤液澄清，备用。

2.4.2 净化

2.4.2.1 大米、玉米、小麦、花生及其制品、植物油脂： 将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL（ ）样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL（ ）色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.4.2.2 酱油： 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10mL（ ）酱油样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱。用10.0mL 0.1%的吐温/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL（ ）色谱级甲醇洗脱，流速为1mL/min~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.4.2.3食醋： 将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL（ ）食醋样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，用10mL 0.1%的吐温/PBS溶液清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2 mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL（ ）色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

2.4.3测定

2.4.3.1    高效液相色谱条件

流动相：甲醇-水（45+55）

流速：0.8mL/min

柱后衍生化系统

衍生溶液：0.05%碘溶液

衍生溶液流速：0.2mL/min

反应管温度：70°C

反应时间：1min

2.4.3.2    定量

用进样器吸取100mL黄曲霉毒素标准工作液（2.2.17）注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰高或峰面积），得到黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液高效液相色谱图。参考谱图见图1。

   

 

 

图1  黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2的标准谱图

 

取样品洗脱液1.0mL加入重蒸馏水定容至2.0mL，用进样器吸取100mL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）。经过与黄曲霉毒素标准液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的浓度 。

2.4.4 空白试验

    用水代替试样，按2.4.1~2.4.3步骤做空白试验。

2.4.5 结果计算

检测结果按公式（1）计算：

                        …………（1）

      

式中： — 试样中黄曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）的含量，mg/kg；

      — 试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 空白试验黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 最终甲醇洗脱液体积，mL；

      — 最终净化洗脱液所含的试样质量，g；

      — 试样称取量，g；

      — 样品和提取液总体积，mL；

      — 稀释用样品滤液体积，mL；

      — 稀释液体积，mL；

      — 通过亲和柱的样品提取液体积，mL。

    黄曲霉毒素总量为B1、B2、G1、G2个别浓度之和，即B1+B2+G1+G2。

注：计算结果需扣除空白值。

计算结果表示到小数点后2位。

 

3 免疫亲和层析净化荧光光度法

3.1 方法提要

试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）总量。

3.2 试剂和溶液

3.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯

3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

3.2.5 苯：色谱纯         不要去掉

3.2.6乙腈：色谱纯

3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

3.2.8氯化钠（NaCl）

3.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）

3.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）

3.2.11氯化钾（KCl）

3.2.12  溴溶液储备液（0.01%）：称取适量溴，溶于水，配成0.01%的储备液，4℃避光保存。

3.2.13  溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。需每次使用前配制。

3.2.14      二水硫酸奎宁（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）

3.2.15  硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。

3.2.16  荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）用0.05 mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于20 mg/L黄曲霉毒素标准溶液。

3.3 仪器和设备

3.3.1 荧光光度计

2.3.2 高速均质器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.3 黄曲霉毒素免疫亲和柱。

2.3.4 玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。

2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.6 玻璃试管：直径12 mm ，长75mm，无荧光特性。

2.3.7 空气压力泵。

3.4 分析步骤

3.4.1提取

同本标准2.4.1。

3.4.2 净化

同本标准2.4.2。

3.4.3测定

3.4.3.1    荧光光度计校准

    在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0 mg/L；以荧光光度计校准溶液（3.2.16）调节荧光光度计的读数值为20.0 mg/L。

3.4.3.2    样液测定

取上述净化后的甲醇洗脱液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混匀，静置1min，按3.4.3.1条件进行操作，于荧光光度计中读取样液中黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）的浓度 （mg/L）。

3.4.4空白试验

用水代替试样，按3.4.1~3.4.3步骤做空白试验。

3.4.5结果计算

检测结果按公式（2）计算：

                        …………（2）

      

式中： — 试样中黄曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）含量，mg/kg；

      — 试样中黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 空白试验黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 最终甲醇洗脱液体积，mL；

      — 最终净化洗脱液所含的试样质量，g；

      — 试样称取量，g；

      — 样品和提取液总体积，mL；

      — 稀释用样品滤液体积，mL；

      — 稀释液体积，mL；

      — 通过亲和柱的样品提取液体积，mL。注：计算结果需扣除空白值。

        计算结果表示到小数点后1位。