cDNA文库的构建

分为六个阶段：

阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链

阶段2：cDNA第二链的合成

阶段3：cDNA的甲基化

阶段4：接头或衔接子的连接

阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接

[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]

1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：

poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl₂ 2μl

dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制剂（选用） 25单位

加H₂O至 48μl

2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-³²P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。

4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。

5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。

6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：

[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)

7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。

[阶段2：cDNA第二链的合成]

1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：

10 mmol/L MgCl₂ 70μl

2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl

10 mCi/ml[α-³²P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl

1 mol/L (NH₄)₂SO₄ 1.5μl

RNase H (1000单位/ml) 1μl

大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl

温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。

2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：

β-NAD (50 mmol/L) 1μl

大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl

室温温育15min。

3．温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。

4．取出3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。

5．将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。

6．将下列试剂加到DNA溶液中：

10×T4多核苷酸激酶缓冲液 10μl

T4多核苷酸激酶（3000单位/ml） 1μl

室温温育15分钟。

7．测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，并按分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法测定1μl第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。

8．用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。

[第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二链合成量/μg

x表示cDNA第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的70~80%

9．用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。

10． Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。

11． 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。

12． 用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。

13． 小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。

14． 如果需要用EcoR I甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要将cDNA直接与Not I或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。

[阶段3：cDNA的甲基化]

1．在cDNA样品中加入以下试剂：

2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl

5 mol/L NaCl 2μl

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl

20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl

加H₂O至 96μl

2．取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和2号，置于冰上。

3．在余下的反应混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000单位/ml），保存在0℃直至步骤4完成。

4．再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为3号和4号。

5．在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。

6．所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h。

7．于68℃加热15min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。

8．在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，混匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。

9．按下述方法分析4个小样对照反应：

a. 在每一对照反应中分别加入：

0.1 mol/L MgCl₂ 2μl

10×EcoR I 缓冲液 2μl

加H₂O至 20μl

b. 在2号和4号反应管中分别加入20单位EcoR I。

c. 四个对照样品于37℃温育1h，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

10． 微量离心机以最大速度离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。弃上清，加入200μl 70%乙醇洗涤沉淀，重复离心。

11． 用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将DNA溶于29μl TE（pH8.0）。

12． 尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。

[阶段4：接头或衔接子的连接]

cDNA末端的削平

1．cDNA样品于68℃加热5 min。

2．将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂：

5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl

dNTP溶液，每种5 mmol/L 5μl

加H₂O至 50μl

3．加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml），37℃温育15min。

4．加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以终止反应。

5．用酚：氯仿抽提，再通过Sephadex G-50离心柱层析，除去未掺入的dNTP。

6．在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇，样品于4℃至少放置15 min。

7．在微量离心机上以最大速度离心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).

接头-衔接子与cDNA的连接

8．将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2μl

800~1000 ng的磷酸化接头或衔接子 2μl

T4噬菌体DNA连接酶（10⁵ Weiss单位/ml） 1μl

10 mmol/L ATP 2μl

混匀后，在16℃温育8~12h。

9．从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃，其余反应液于68℃加热15min以灭活连接酶。

[阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]

Sepharose CL-4B柱的制备

1．用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。

2．将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。

3．在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基质几乎充满吸管为止。

4．将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。

依据大小分离回收DNA

5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50μl或更小），放开止血钳，使cDNA进入凝胶。用50μl TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。

6．用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管2滴，直至将所有放射性洗脱出柱为止。

7．用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。

8．从每一管中取出一小份，以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片断作标准参照物，通过1%琼脂凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20℃，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。

9．电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器上干燥。干燥过程前20min至30min于50℃加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥1~2h.

10． 置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。

11． 在cDNA长度≥500bp的收集管中，加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量离心机于4℃以12 000g离心15min，以回收沉淀的cDNA。

12． 将DNA溶于总体积为20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13． 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于λ噬菌体臂相连接的DNA总量。

[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到第二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二链合成量=可用于连接的cDNA

[阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接]

1．按下述方法建立4组连接-包装反应：

连接	A(μl)	B(μl)	C(μl)	D(μl)
λ噬菌体DNA(0.5μg/μl)	1.0	1.0	1.0	1.0
10×T4DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0	1.0
cDNA	0 ng	5 ng	10 ng	50 ng
T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml）	0.1	0.1	0.1	0.1
10 mmol/L ATP	1.0	1.0	1.0	1.0
加H2O至	10	10	10	10

连接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA储存于-20℃。

2．按包装提取物厂商提供的方法，从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中。

3．包装反应完成后，在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基。

4．预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物，包装混合物做100倍稀释，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培养8~12小时。

5．计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑，连接反应A不应产生重组噬菌斑，而连接反应B、C和D应产生数目递增的重组噬菌斑。

6．根据重组噬菌斑的数目，计算cDNA的克隆效率。

7．挑取12个重组λ噬菌体空斑，小规模培养裂解物并制备DNA，以供适当的限制性内切核酸酶消化。

8．通过1%琼脂凝胶电泳分析cDNA插入物的大小，用长度范围500bp~5kb的DNA片段作为分子质量参照。