接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。因此，材料在接种前必须进行灭菌。灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长时间，均应根据材料对药剂的敏感情况仔细敲定。
经常使用的灭菌剂有次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉、溴水和低浓度的氯化汞等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。但氯化汞灭菌后，汞离子在材料上不易去掉，必须将材料用无菌水多清洗几次。
外植体的灭菌工作应在接种室或接种箱内无菌的条件下进行。
花药的灭菌
用于组织培养的花药，按小孢子发育时期要求，实际上大多没有成熟，花药外面有萼片、花瓣或颖片、稃片保护着，通常处于无菌状态。所以一般只对整个花蕾或幼穗进行灭菌。如茄（Solanum melongena L.）的花药，灭菌时先去掉花蕾的萼片，用70%酒精擦洗花瓣，然后将整个花蕾浸泡在饱和漂白粉上清液中10分钟，再经无菌水清洗2～3次，即可接种。这一灭菌程序，也适用于其它植物花药的灭菌。
果实及种子的灭菌
灭菌前，先将果实、种子用纯酒精迅速漂洗一下或将种子浸泡10分钟。对于果实，一般再用2%的次氯酸钠溶液浸泡20～30分钟甚至几小时，持续时间视种皮硬度而定。对用作胚或胚乳培养的种子，如种皮太硬，则在灭菌前先去掉外种皮，再用4～8%次氯酸钠溶液浸泡8～10分钟，用无菌水清洗后，即可剖出胚或胚乳进行接种。
茎尖、茎段及叶片的灭菌
灭菌方法与花药的灭菌方法相同。对于茎叶，因为暴露在空中，且生有毛或刺等附属物，所以灭菌前应该用自来水冲洗干净，用吸水纸将水吸干，再用70%酒精漂洗一下。然后，根据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，用2～10%次氯酸钠溶液浸泡6～15分钟，用无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干后进行接种。
根和贮藏器官的消毒
这类材料大多埋于土中，材料上常有损伤及带有泥土。灭菌比较困难。灭菌前，要用自来水清洗，并用毛刷或毛笔轻轻刷洗去掉污物，吸干后用70%酒精漂洗一下，再用0.1～0.2%的氯化汞灭菌5～10分钟，或用6～8%次氯酸钠溶液浸5～15分钟，接着用无菌水清洗及用无菌纸吸干，然后进行接种。