免疫荧光技术

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
　　由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
　有关荧光的基本知识
一、荧光现象
（一）荧光的产生
　　一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。
　　荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。
　　可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率
　　荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
　　荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）
　　发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。
（三）荧光的猝灭
　　荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。
二、荧光物质
（一）荧光色素
　　许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
　　1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：
　　有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
　　2．四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：
　　最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
　　3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：
　　最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
（二）其他荧光物质
　　1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
　　2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3 螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
免疫学基本常识：抗原、抗体及单克隆抗体
　 众所周知，人或动物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵袭，也有一些疾病可以通过机体自身调控而自愈，这是因为机体内部存在一个免疫系统。免疫系统是由中枢免疫组织（骨髓、胸腺、消化系统免疫组织）和外周淋巴组织（淋巴结和脾脏）的免疫活性细胞（B淋巴细胞、浆细胞），以及由它们产生的多种淋巴因子和抗体所组成。免疫系统对外来物质产生一系列反应的过程称为免疫，而这种反应本身则称为免疫应答。能够在机体中引起特异性免疫应答的物质称为抗原，免疫应答的结果则是刺激机体产生与抗原相对应的特异性抗体和引起细胞免疫。
由于免疫应答同时取决于机体，而不仅是进入机体的物质，所以抗原的定义是相对的。由此，按照免疫应答的效果可以将抗原分为完全抗原和半抗原：完全抗原是指能够直接诱导机体产生特异性免疫应答的一类物质。完全抗原的分子量都大于5000，其化学成分多为蛋白质或脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖体，多肽，核酸等也都是完全抗原。半抗原能与抗体特异性结合，但不能激发机体产生抗体，必须与蛋白质（载体）结合后进入机体，才能产生有效的免疫应答。大分子的半抗原在体外能与对应的抗体结合发生可见反应（凝集、沉淀），小分子的半抗原能与对应抗体结合而不出现可见反应。此外，抗原还可以按照自身的物质属性分为可溶性（毒素、异种蛋白）或颗粒性（细菌、细胞）抗原，或按临床意义分为外源性和内源性抗原。
抗体是在抗原刺激下机体免疫应答的产物。所有抗体都具有与抗原特异性结合的能力。抗体的化学本质是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不过只有当免疫球蛋白针对已知抗原时，才能够称这种免疫球蛋白为抗体。免疫球蛋白属于结构牢固的分子物质，可以经受较大变化的环境作用，诸如56℃加温，在室温下较长时期的贮藏，短期高或低pH处理，甚至与去污剂或尿素接触后仍保持其抗体活性。
抗体活性是指与抗原特异性结合的能力，即二者之间的特殊亲合力。两者非共价键结合，结合的力包括氢键，静电力，范德华力和疏水结合力。抗体抗原之间的反应是可逆的，在适宜的条件下仍可解离而性质不变。
机体内约有1亿种不同的B淋巴细胞，每个独立的B淋巴细胞只能接受一种抗原的刺激从而形成分泌一种抗体的能力，因此特异性是免疫应答的特有标志。如常识所见，麻疹患者愈后即获得对麻疹的终生免疫，而这并不形成对天花的免疫。抗体抗原特异性结合的本质是抗原决定簇与抗体结合簇的专一适配性，抗原决定簇是指抗原分子上专有的化学基因，可以决定其刺激机体所产生抗体的特异性。抗原决定簇与其相对应的抗体结合簇立体构型完全相适应。一个抗原分子可带有多个不同的决定簇。抗原分子量愈大，决定簇数量愈多。决定簇数目代表抗原分子的价。抗体结合簇是在抗体分子上与对应的抗原决定簇发生特异性结合的部位，位于Ig分子的抗原结合分段（V段）上，由重链和轻链的一部分可变区构成。其特异性由氨基酸排列顺序决定，约包括5～15个氨基酸。每个单体免疫球蛋白分子如IgG有2个结合簇，IgA是二聚体，有4个结合簇，IgM是五聚体所以有10个结合簇。(但是，事情并不是绝对的。一种抗体除与相对应的抗原发生特异性反应外，也有可能与化学结构部分相似的其它抗原发生反应，这就是通常所说的交叉反应。交叉反应可能由于两种抗原有共同的决定簇，或由于两者的抗原决定簇虽然不完全相同，但在立体化学结构上密切相关，导致一种抗原能与另一种抗原的对应抗体结合。)
正常情况下，抗体与抗原在机体内结合后，可以被吞噬、排泄而将抗原清除。如果这种抗原属于外源性致病抗原（细菌、病毒、毒素），可以由此达到杀灭或削弱抗原危害的目的。对于内源性抗原，如已经衰退、损伤或突变的异常细胞，也能被及时排除，实现机体自身的免疫调控。当然，在异常情况下，抗体抗原结合后形成的免疫复合物将损伤组织、细胞，引起花粉过敏一类的变态反应或免疫性疾病等不良后果。
不过长期以来所谓特异性免疫血清抗体，不论是从人还是从动物获得的，也不论是主动获得还是被动获得的，实际上都是有许多种具有不同特性的抗体所组成的混合抗体。这是因为，进入机体的抗原往往带有若干个抗原决定簇。此外，不同个体对同一抗原决定簇的反应并不相同，即使同一个体不同时间接受抗原刺激后产生的反应也不完全一致。由于人们无法将体内已受抗原刺激的各种不同的B淋巴细胞克隆区分开，即使在体外能将它们分成单细胞，也无法让其继续生长，增殖并分泌抗体。因此，用常规免疫方法制备的免疫血清抗体只能是数目众多的单克隆抗体的混合物，现在，一般称其为多克隆抗体（PcAb）。这种多克隆抗体存在特异性差、效价低、数量有限、动物间个体差异大，难以重复制备等固有缺陷，许多场合下使用时难尽人意。
1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein合作发表了题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”的著名论文（Nature,256:495,1975）。他们将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体，通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系，由此单克隆系就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（McAb）。上述方法创立了一项具有划时代意义的新技术－利用B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体。这一技术的创立和迅速推广，为所有需要制备和使用抗体的研究领域提供了全新的手段和制剂，促进了生命科学诸学科的发展。两位科学家也由于这一杰出贡献荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。
黄曲霉毒素B1是一种二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，分子量为312，属于半抗原，不能直接诱导机体产生免疫应答。因此我们的工作首先是将黄曲霉毒素B1与载体蛋白连接，合成为完全抗原，以后的研究则基本上采用了前述杂交瘤－单克隆抗体技术的经典方法：动物免疫→免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合→细胞筛选→用有限稀释法分离出可分泌特异性抗体的单个细胞，再经过克隆化培养建立杂交瘤细胞株并制备出大量单克隆抗体，从而在此基础上最终建立了黄曲霉毒素B1（AFB1）的免疫检测方法。
免疫标记法
（一） 荧光免疫法：
原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
　 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
（二） 放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
(三) 　酶联免疫法(ELISA)
ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
以双抗法为例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—抗体复合物。最后加入底物，由酶催化底物生成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。
（四）偶联生物素—亲和素系统的酶免法
利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
（五）时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
(六) 解离增强镧系元素荧光免疫分析
解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3 从复合物上解离下来，自由Eu3 同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。