1 原理
中性粒细胞中的碱性磷酸酶(简称碱酶)在一定条件下能使β-甘油磷酸钠水解释出无机磷, 后者与钼酸试剂结合成磷钼酸复合物, 再以氨基萘酚磺酸还原为钼蓝而呈现蓝色,用光电比色法求得所释放的无机磷含量,表示酶的活性。
2 试剂
a.葡聚糖:分子量20万,用生理盐水配制成2%溶液,在冰箱中可保存一个月。
b.β-甘油磷酸钠溶液(0.026M):称取β-甘油磷酸钠溶于碳酸—重碳酸盐缓冲溶液,将pH调至9.9,液面盖一层石油醚,在冰箱内保存。
c.碳酸-重碳酸盐缓冲液:
A液 称取无水碳酸钠2.12g,溶于重蒸馏水100ml,配成0.2M无水碳酸钠溶液。
B液 称取碳酸氢钠1.68g,溶于重蒸馏水100ml,配成0.2M碳酸氢钠溶液。
取A液100ml与B液100ml混合,加重蒸馏水600ml,pH为9.9。
d.皂素:用生理盐水配成2%溶液。
e.氯化镁溶液(0.05M):用重蒸馏水配成。
f.三氯乙酸溶液:用重蒸馏水配成50%及5%二种浓度。
g.钼酸铵溶液:称取钼酸铵12.50g,溶于重蒸馏水100ml,加10M硫酸150ml,再加重蒸馏水到500ml。
h.0.25%氨基萘酚磺酸溶液:称取氨基萘酚磺酸0.0625g、亚硫酸氢钠1.33g、亚硫酸钠0.25g,于研钵中磨成细粉,加重蒸馏水到25ml,过滤后保存于冰箱内。用时稀释一倍。
i.标准磷储备液(每毫升含无机磷1mg): 称取干燥恒重的分析纯磷酸二氢钾2.1971g置于容量瓶中,加重蒸馏水至500ml,加氯仿2滴,在冰箱内保存。
j.肝素:用生理盐水配成1%溶液。
3实验方法
3.1 白细胞分离
自耳垂或手指取血0.15ml,置于预先准备好的含1滴肝素和0.30ml葡聚糖溶液的微量试管中,用手振摇混匀,静置10分钟。待红细胞沉降界面清晰时,小心吸出上层悬浮液,置于小离心管中,加入2倍生理盐水,摇匀后离心(2500转/分钟)8分钟。取出上清液弃去,保留沉淀。再向有沉淀的离心管加生理盐水2ml,混匀,再离心8分钟。重复2次,弃去上清液,管中留下液体约0.15ml,与沉淀混匀,即为白细胞悬浮液, 作白细胞计数2~4次,取其
平均值。 此白细胞悬浮液供酶活性测定之用。如不能立即测定,需放置冰箱内,
但必须在当天测定。
3.2 白细胞碱酶活性的测定
取一小试管, 加入β—甘油磷酸钠 0.85ml , 皂素 0.05ml,
氯化镁0.02ml,于37℃水浴中预热5分钟,然后准确加入白细胞悬浮液0.05ml,混匀, 继续保温60分钟,到时立即加入50%三氯乙酸0.15
ml使反应终止, 以2500转/分离心10分钟,除去沉淀。
每个样品都需作对照管测定,对照管所加内容物同上,仅白细胞悬浮液须在保温后加50%三氯乙酸后加入。
分别取样品和对照管上清液0.80ml,各加入钼酸铵试剂0.15ml,氨基萘酚磺酸溶液0.10ml,重蒸馏水1.45ml,显色20分钟,用分光光度计测定光密度( 所用波长为660nm、比色杯厚10mm ),分别读取样品管、对照管的光密度。每管重复读数两次,取其平均值。
3.3 磷标准曲线的制定
取标准磷储备液, 用5%三氯乙酸稀释成不同浓度的标准磷应用液, 浓度分别为:1.0,3.0,5.0,7.5,10.0mg/1。然后取试管5支,分别在每一试管加入1.0ml上述标准磷应用液之一种, 以及钼酸铵0.15
ml, 氨基萘酚磺酸0.10ml,重蒸馏水1.25ml,按上法显色,读取
各管的光密度,绘制标准曲线图。
3.4 白细胞分类计数
在取血分离白细胞的同时,取1滴血作涂片,瑞氏染色,按常规分类计数嗜中性白细胞的百分比。
3.5 计算方法
白细胞碱酶活性用单位表示,以每十亿个中性白细胞在37℃条件下,1小时释放出1mg无机磷为一个单位。计算公式如下:
酶活性(单位)={〔pi(样)—pi(对)〕×10000×1.40}÷(W·V·N)
式中:pi(样)——样品管无机磷,μg;
pi(对)——对照管无机磷,μg;
W——白细胞悬液的白细胞数,个/立方毫米;
V——酶反应所加入白细胞悬液的量,ml;
N——嗜中性白细胞,%。
注:为减少操作误差,提高结果准确性,也可自静脉采血1.5ml,按常量法进行操作。详见《卫生研究》5(6):481,1976。
4 注意事项
a.白细胞悬液必须充分摇匀,不应有聚集的细胞。白细胞计数要准确,一般应计数2~4次,取平均值。
b.碱酶活性测定中,白细胞悬液的加入量要准确,吸取时注意摇匀。
c.碱酶反应保温时间(60分钟)要准确。
d.显色反应不应出现沉淀。
e.用分光光度计读数时,样品管与对照管都应重复两次。