免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR)

一、定义；
免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。
用抗体检测抗原是免疫学的最基本方法，用酶或同位素标记抗体可使检测的敏感性提高，常用的定量检测方法ELISA和RIA均基于标记分子可以使检测的信号增强。免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
二、基本原理：
免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(Protein A-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。
PCR由 ①待测抗原；②生物素化抗体；③亲和素（连接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR扩增五部分构成。
1 待检抗原
被检测的样品可以是抗原，或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相，这一过程与ELISA试验是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能应用目前介绍的免疫PCR方法进行检测，需要对免疫PCR进行改进，以便能够检测吸附性差的抗原。免疫PCR的后续过程需PCR扩增，目前有些方法应用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR仅可以直接用微量板进行扩增，这样可以简化实验过程和提高检测的精确性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特别适用于检测微量抗原。
2 特异抗体
免疫PCR中的特异抗体是对应于待检抗原，与ELISA一样，抗体的特异性和亲合力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单克隆抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和素再结合DNA。
3 连接分子
连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌A蛋白-亲和素嵌合蛋白(SPA-亲和素)。其具有结合IgG和生物素的两个位点，因此可以将IgG与生物素化的DNA连接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂，且SPA不但可以结合特异抗体的IgG，而且还可以与样品中吸附于固相的无关IgG结合，特别是检测的抗原就是某种IgG，因此，Ruzicke认为Sano的免疫PCR本底高和特异性差。Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR，这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物，然后再与结合固相的特异性抗体结合，这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例并不是等同的，一个亲和素分子可以结合4个分子生物素，因此在预结合时生物素化的DNA分子不能过多，否则DNA分子上的生物素将亲和素完全饱和，亲和素再无结合生物素化抗体的能力;但在低饱和生物素化DNA时，亲和素结合的生物素化DNA存在许多种类的复合物，甚至还有游离的亲和素，只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接分子的作用，因此，这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测试过程中的1次孵育和冲洗，但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大，并且每次制备的连接分子均有差异，从而导致重复性差。
Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法，连接分子是链亲和素，在连接抗体和DNA时是以游离的方式加入，这样链亲和素先与生物素化抗体结合，冲洗后，再加入生物素化的DNA。这个方法虽然多了1次孵育和冲洗过程，但具有较好的敏感性和重复性。
4 DNA和PCR系统
免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上，一般是一个分子DNA标记两个生物素，标记率可达百分之百。生物素化的DNA用量需预先选定，过多易出现非特异结合而引起本底过高，过低将导致敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。
免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为固相必须有配套的PCR仪，以使可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。
三、主要程序
（一）抗原 生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
（二）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；
（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；
（四）PCR扩增生物素化DNA部分。
四、制作方法
（一）制备生物素化DNA
将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNA片段，即为生物素化DNA。
（二）免疫PCR模式
1 试剂
包被缓冲液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5)，含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗涤液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀释液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1)包被
用包被缓冲液稀释抗原(BSA)，加入微滴板中(45μl孔)，4℃过夜(约15h)，用洗涤液洗板3次×5min。
2)封闭:
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA(1mg/ml)、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。
3)抗原抗体反应:
用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温(～22℃)下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。
4)链亲合一蛋白A结合反应:
每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温(～22℃)50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
5)PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI(20℃pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2、明胶(10μg/ml)、0.8mmol/LdNTPs(每种0.2mM)、2μM引物(每一引物1μM)和TaqDNA多聚酶(50U/ml)。
PCR周期 PCR前，用紫外线(UV)(254nm)照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期:起始变性94℃5min;30个周期:变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。
参考流程
1. 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度。
2. 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）。
3. 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次。
4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清(NGS) PBS封闭2小时.
5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
6. 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体(内含100μg的鲜鱼精DNA),室温孵育30min.
7. 用TPBS洗涤五次.
8. 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体,室温孵育30min.
9. 用TPBS洗涤五次.
10.加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素,室温孵育30min.
11.用TPBS洗涤五次,再用HPLC级水洗三次.
12.PCR扩增:加入50μl PCR反应液(内含T3和T7引物),95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec,循环30次.取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳,和核酸分子量标准相比较,在相应的位置邮现电泳带为阳性.必需时将电泳结果照像,进行定量分析.
3 PCR产物的检测与定量技术
1）凝胶检测系统 用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达fg水平，但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵，所以现在仅用于研究。
2）HPLC检测系统 此法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达fg水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
3） 固相测定系统 最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数，可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量，将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方方法为:双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体:AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色，亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay)系统 用亲合素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物，此捕获过程可使与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，此法具有更大的线性范围。
5）点杂交检测系统 将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面，与标记的DNA探针杂交，亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T)尾巴固定于膜上，与变性后的已标记的扩增产物杂交，在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面，故其反应动力学接近于液相，反应速度快，通常使用生物素化的探针或扩增产物，用亲合素-AP结合物产生颜色斑点，通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
6） 电化学发光检测系统 通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2，2'-联吡啶-钌螯合物(TBR)标记的探针杂交，加入三丙胺(tripropylamine，TPA)溶液，并转移至电化学发光仪的检测池，当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，此法的敏感性为amol水平，可自动化测量。
7） DNA酶免疫测定系统 通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
8） 激光诱导荧光检测法 首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。
总之，可用上述方法对靶基因定量，其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。由于亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点，有较好的临床应用前景。定量PCR仍然存在技术上的问题，目前多用于研究，但在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面对此技术的需求将日益增加。
五、免疫PCR的应用和发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，还没有一个十分成熟和满意的方法，配套试剂尚缺乏，所以应用的还不多，在报道的几种方法中均是用一些已知的标准品进行试验。Sano，Ruzicka和Hong zhou分别用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重组人原癌基因产物ETS;蛋白作为待检抗原进行免疫PCR，他们的结果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。目前介绍的免疫PCR还存在一些缺点，在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响;同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。另外，有些难于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR检测，连接分子的特异性和均质性对PCR影响很大，从理论上看Hong zhou的生物素标记抗体和DNA以及用游离的链亲和素连接抗体和DNA是一比较理想的方法，但是如能做到生物素化抗体、亲和素和生物素化DNA3个分子预先连接一个复合物，那么将简化实验过程。PCR扩增过程相对简单，如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。固相也可以直接采用某些PCR反应管，并且可以直接用一般的PCR仪进行扩增，但冲洗过程相对复杂一些。免疫PCR具有非广泛的应用前景，十分有必要进一步完善免疫PCR的实验过程和配套试剂的研制。
六、参考文献
[1] T.Sano， Bio/Technology. 1378， 1991
[2] T Sano et al， Science 258， 120， 1992
[3] V. Ruzicka et al， Anal. Chem.， 65， R420， 1993.
[4] Ruzicha， V.， Marz， W.， Russ， A. and Gross， W.， (1993) Immuno-PCR with a commercially available avidin system. Science 260， 698-699.
[5] Sano， T.， Smith， C. L. and Cantor， C. R. (1992) Immuno-PCR:very sensitive antigen detection by means of specifi antibody-DNA conjugates. Science 258， 120-122.
[6] Sanna， P. P.， Weiss， F.， Samson， M. E.， Bloom， F. E. and Pich， E. M. (1995) Rapid induction of tumor necrosis factor a in the cerebrospinal fluid after intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide revealed by a sensitive capture immuno-PCR assay， Proceedings of the National Acudemy of Science USA 92， 272-275.