(一)原理
利用酶标记抗原(抗体)和待测抗体(抗原)在电场中向一定方向移动,在比例适当的地方形成沉淀线,通过酶作用底物而显色,指示沉淀线的存在。该法的敏感性大大高于对流免疫电泳。
本试验以检测血吸虫抗体为例。
(二)材料与试剂
1.0.02Mol/pH 8.6巴比妥缓冲液
巴比妥 0.553g
巴比妥钠 3.503g
乳酸钙 0.512g
H2O 加至 1 000ml
2.0.1Mol/L pH7.0PBS(0.14Mol/L Nacl)
3.0.2Mol/L pH7.6硼酸缓冲液
硼酸 10.510g
硼砂 2.860g
H2O 加至 1000ml
(三)操作方法
1.酶标抗原的制备 用1ml血吸虫卵抗原(蛋白含量为1.5mg/ml~2.0mg/ml)加入3mg~4mg辣根过氧化物酶(蛋白质:酶=1︰2),液体呈棕红色,然后在轻轻搅拌下,缓慢加入50μl 1%戊二醛,要求在5min~10min内滴加完毕。置20℃~25℃搅拌2h。装入透析袋,于1000ml、0.1Mol/L pH7.0PBS液4℃透析2天,并换液3次~4次。取出酶标记物加等量纯甘油,使含50%甘油试剂,即为酶标抗原。分装小瓶,存于-20℃中备用。
2.琼脂凝胶板的制备 取优质琼脂,以0.02Mol/L pH8.6巴比妥缓冲液制成1%琼脂,溶化后,置于玻片上,制成2mm厚的凝胶板。
3.打孔加样 打6对孔,抗原孔径为0.30cm,抗体孔为长方形0.2cm×1.1cm。抗原、抗体各加5μl及50μl。抗原用上述酶标抗原做1︰20至1︰30稀释。
4.电泳 抗原孔置于负极,电压4 V/cm ~5V/cm,电泳时间45min~60min,电泳后,于蒸馏水中荡洗1min~2min即可,用滤纸吸去水分,并用毛细吸管吸尽长孔及圆孔中的水液后,即可用底物的溶液显色。
5.配制底物溶液,现用现配。将饱和联苯胺溶液,加等量pH7.6硼酸缓冲液,然后将上液9份和0.1%过氧化氢1份相混,即为所需的底物溶液。
6.免疫酶染色 将琼脂凝胶板置于培养皿中,缓缓倾入底物溶液,直至浸没凝胶板为止,置于室温或37℃,经1h~2h用目测可观察反应结果。
(四)结果判定
1.阳性反应:在抗原抗体孔之间呈现明显的棕红色的线条。
2.阴性反应:不出现棕红色线条者。