标记抗原的放射免疫技术（ＲIA）

当抗原遇到相应的抗体便形成抗原抗体复合物（Ag＋Ab ↔Ag －Ab），当用放射性同位素标记抗原再与相应的抗体结合便形成标记抗原和抗体复合物。即： Ag Ab↔ Ag－Ab。当标记抗原和未标记抗原一起加入相应的抗体时则两种抗原产生相互的竞争，而生成有标记抗原和抗体复合物以及非标记抗原和抗体复合物。生成标记抗原抗体复合物与非标记抗原的含量在一定的限度内是呈反比的，所以利用这个原理去测定未知抗原或抗体。

﹡Ag Ag Ab Ag（F）

＋Ab

Ag Ag Ab（B） Ag

如果Ag多则*Ag－Ab（即结合抗原B）生成量减少，*Ag（即游离抗原F）的剩余量就多。相反，Ag少，则*Ag－Ab生成量就多，*Ag的剩余量就少。通过检测游离抗原F和结合抗原B，就可知未知抗原的存在与否以及含量的多少。

1、完全抗原 为了保证免疫反应的特异性，对放射免疫抗原要求的纯度较高，必须在90%以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。纯化的抗原必须经过纯度鉴定才能使用。鉴定办法：通过电泳只出现一条沉淀线，或者以圆盘电泳进行纯度分析。

2、半抗原 要获得较好的免疫原性，必须将半抗原与蛋白质大分子的载体结合起来形成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等。连接方式则因半抗原的功能基团与蛋白质载体功能基团所决定。常用的连接剂有二亚胺、二异氰酸、过碘酸盐等。

见第八章免疫球蛋白的制备与提纯。

1．放射性同位素的选择 选择同位素的原则。

⑴ 定方法简单、经济、便于推广应用。

⑵ 易于防护。

⑶ 同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。

⑷ 对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。

⑸ 具有较高的计数效率。

目前常用的同位素有³H、¹²⁵ I，其它还有¹⁴C、³⁵S和³²P等。① ³H 因所有的有机化合物中均含有氢，用³H来置换氢，不至于影响其原有化合物的化学性质。³H的半衰期长，是一个弱 衰变，能量低，便于防护。一次标记可以使用较长时间，采用闪烁仪测量，测量效力可达60%。³H标记要求条件较高，一般需由专门机构来承担，不易推广；② ¹²⁵I 碘标记的化合物比度高，标记方法简便，而且标记物可在碘化钠晶体﹟型计数器上直接测定。¹²⁵I发射 射线，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可用放射性I标记。目前，连接标记技术已有相当发展，致使许多非蛋白质和多肽的半抗原也可以用碘来标记。另外碘的放射能量较大，半衰期也较短。

虽然¹²⁵I的放射比活性仅为¹³¹I的13%，但¹²⁵I的半衰期较¹³¹I长，同位素丰度大，辐射损伤小，计数效率也较高，因此¹²⁵I比¹³¹I更为常用。

表 各种标记同位素的性质比较

2．标记方法 目前常用的是碘标记法。碘化标记的方法很多，如氯化碘法、乳过氧化酶法、过氯酸法和连接标记法等。但比较起来，氯胺T法最为简便，效果好，易于采用。

氯胺T碘化标记法的原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液中可以缓慢地释放次氯酸，因而可以在标记的过程中形成一种能产生温和氧化效果的中间体，它可使放射性碘离子氧化而呈活泼形式的碘离子，并取代抗原分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或二个氢原子，使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。其记过程为：

⑴ 将蛋白质抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀释为20μg/μl，取5μl~10μl。

⑵ 取Na¹²⁵I 5μl(含2mci~3mci)。

⑶ 将1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。

⑷ 再将Na¹²⁵I和氯胺T分别缓缓加入蛋白质液中，于冰浴中边加边搅拌，加完后再搅拌5min。

⑸ 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸钠(以PB液配制)。

⑹ 再加1%碘化钾液1滴，看液体是否完全透明。如仍呈棕色，应继续加少许的偏重硫酸钠。

⑺ 过SephadexG50柱，取第一峰，即为碘标记的蛋白质抗原。

3．标记的最佳条件

⑴ 放射性碘比活性要高。

⑵ 反应体积要小。

⑶ 标记反应的pH值，以pH7.5为宜，超过8.5，碘则取代酪氨酸以外的其它成分。

⑷ 氯胺T的用量必须事先测定。其方法为定出在标记的蛋白质存在时，10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必须适当。用量少，虽能满足反应的要求，但产率低；用量大易使蛋白质变性。

⑸ 蛋白质的浓度决定碘化的效率。对含量中等的氯胺酸的蛋白质而言，在蛋白质浓度为1mg/ml，蛋白质的回收率为100%，浓度为300μg/ml，则为80%～90%，当浓度降至50μg/ml时，则回收率只有60%～70%。

4．标记物的鉴定

⑴ 放射性化学纯度鉴定是指某一化学形式的放射性物质的放射强度在该样品中所占放射性总强度的百分比。鉴定方法为：取标记的蛋白质或多肽抗原液少许，加入1%～2%载体蛋白及等量的15%三氯醋酸，摇匀静置数分钟后，3 000r/min离心15min分别测上清液(含游离碘)及沉淀(含标记抗原)的放射活性。一般要求游离碘含量占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮藏较久后，仍有部分放射碘从标记物上脱落下来，使用时应除去后再用，否则影响放射免疫分析的精确度。

⑵ 免疫化学活性鉴定：采用碘标记的抗原，通常由于氧化剂的作用可引起部分活性的损伤，而采用³H、¹⁴C等标记的抗原，则不改变抗原的化学结构。免疫活性的检查方法：以小量的标记抗原加过量的抗体，在适当的条件下充分反应后，分离B、F，分别测定其放射性，算出百分结合率。此值应在80%以上，最大可超过90%。该值越大，表示标记的免疫化学活性损失越少。

⑶ 放射强度：放射性强度以比度表示。即单位重量抗原的放射性强度。比度越高，敏感性越高。因此根据测定需要的敏感度，要求适当比度的标记抗原。标记抗原比度的计算是依据放射性碘的利用率。

分离方法	(B) 抗原抗体复合物	(F) 游离抗原
平衡透析 清蛋白或葡聚糖衣 活性炭吸附 凝胶过滤 微孔滤膜过滤 电泳和层析电泳 双抗体法 固相抗体法 硫酸胺沉淀法 聚乙二醇(分子量6 000)	在透析袋内 不被活性炭吸附离心 后于溶液中 先被洗脱 在醋酸纤维膜上 在 球蛋白电泳带 被第二抗体沉淀 结合到固相物上 离心后于沉淀中 离心后于沉淀中	袋内外浓度相等 被活性炭吸附于沉淀中 后被洗脱 通过滤膜被洗掉 以其自己的电泳泳动度移动 离心后在上清液中 在溶解相中 在溶液中 在溶液中

以此抗体用量，加入不同稀释度的已知抗原和标记的抗原作用一定时间后，分离B、F，测B的放射性，以标记Ag与抗体复合物的脉冲数或结合率为纵坐标，以未标记抗原浓度的对数为横坐标作图。如得不到直线可通过logit计算，将曲线换成直线。在坐标上，曲线的斜率最大的部分是放射免疫测定的工作范围。斜率越大，敏感性越高，测定范围小。斜率小，工作范围大，而敏感性就较差。