溶血空斑形成试验

溶血空斑形成试验是一种体外检测单个抗体形成细胞(浆细胞)的方法，故又称体外抗体形成细胞(Plaque Forming Cell, PFC)测定技术。此项技术不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，广泛地用于检测产生IgM类型(包括其它各类免疫球蛋白及其亚类)的抗体形成细胞，它还可作为临床筛选抗肿瘤新药以及研究中药对抗体免疫功能影响的免疫学指标。
一、原理：
　　溶血空斑形成试验的基本原理是将经绵羊红细胞免疫小鼠的脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围那些受到抗体分子致敏的绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。根据所操作的方法不同可分为直接溶血空斑试验，间接溶血空斑试验，琼脂固相法，小室液相法，单细胞层法等等。下面介绍直接溶血空斑形成试验。
二、操作步骤：
　　1. 底层琼脂平皿的制备：将1.4％琼脂加热融化后倾注于平皿内，每个平皿6ml，凝固后置湿盒37℃备用。
2. 0.7％琼脂加热融化后加入华氏管内，每管2ml，47～49℃水浴保温备用。
　　3. 免疫小鼠脾细胞悬液制备：用4×10３ 个绵羊红细胞(SRBC)盐水悬液腹腔免疫小鼠，对照为等量生理盐水。4天后，小鼠拉脱颈椎处死，取出脾脏，用RPMI164。洗一次后置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成悬液,洗涤两次,调整细胞数为3～8×10６/ml。台盼兰染色查活细胞数应大于90％。置4℃冰箱备用。
　　4. 试验平皿的制备：依次将预温40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的灭活胎牛血清以及保存于4℃的脾细胞悬液各0.1ml加入预热47～49℃的含0.7％琼脂的华氏管中，迅速混匀，立即倾注于铺有底层琼脂的平皿内，凝固后，置37℃孵育1小时。
5. 加入1∶5～1∶10稀释的新鲜豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均匀覆盖表面,再次置37℃温育30分钟，即可用肉眼或借助于放大镜进行空斑计数。
三、试剂和器材
　　㈠ 试剂
　　1. 1.4％琼脂：用pH7.4PBS配制。
　　2. 0.7％琼脂：用pH7.4PBS配制
3. 25％SRBC盐水悬液
4. RPMI1640
5. 胎牛血清，56℃30分钟灭活，并经SRBC吸收
　　6. 补体：新鲜豚鼠血清，用前经SRBC吸收后，用RPMI1640稀释。
　　㈡ 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角烧瓶，水浴箱(47～49℃)，华氏管，1ml注射器，不锈钢筛网，青霉素瓶，离心管，不同规格加样器等。
四、注意事项：
　　1. 0.7％琼脂必须置47～49℃水浴融态保温。如温度过高会导致SRBC溶血或所加入脾细胞的死亡。温度过低则在操作过程中琼脂发生凝固，影响上层琼脂平板的制备
2. 离体的脾细胞应置4℃冰箱保存，防止抗体分泌和细胞死亡。
　　3. 在制备试验平皿时，对于所有玻璃器皿和各种试剂，均需预温，牭1各种试剂加入华氏管后，应与0.7％琼脂迅速充分混匀，然后立即倾倒于底层琼脂上，并避免倾入气泡。
　　4. 加入的补体应均匀覆盖于表层琼脂上。
　　5. 制备底层平皿和试验平皿时，均须将平皿置于水平台上，以保证琼脂面铺平。