戊二醛二步法制备HRP结合物

　　1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

　　2.　标记步骤：
　　(1)　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
　　(2)　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
　　(3)　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
　　(4)　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
　　(5)　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
　　(6)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
　　(7)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
　　(8)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

　　3.　结果判定：
　　(1)　定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。
　　(2)　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
　　酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
　　IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　 IgG量(mg／ml) 　　酶量
　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量

　　　(3)　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。