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免疫组化常见问题及对策

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-06-27

1、染色过强

原因

解决办法

抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度(一般指浓缩性抗体)抗体孵育时间:室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高,孵育温度超过37 一般室温20-28
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟,以显微镜下观察为准

2、非特异性背景染色

原因

解决办法

操作过程中冲洗不充分

每步冲洗3×5

组织中含过氧化物酶未阻断

可再配置新鲜3%H2O2封闭,孵育时间延长

组织中含内源性生物素

正常非免疫动物血清再封闭

血清蛋白封闭不充分

延长血清蛋白封闭时间

3、染色弱

原因

解决办法

抗体浓度过低,孵育时间过短

提高抗体浓度,孵育时间不能少于60分钟

试剂超过有效使用期

及时更换试剂

操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂稀释

每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(但防止切片干燥)

室温太低,低于15

若室温低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟(或4℃冰箱过夜)

蛋白封闭过度

封闭时间不要超过10分钟

4、染色阴性

原因

解决办法

操作步骤错误

重新试验,设立阳性对照

组织中无抗原

设立阳性对照片,以验证实验结果

一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误

 
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