(一)材料及试剂
1.器材
⑴细胞培养板:灭菌的国产96孔或40孔平底聚苯乙烯塑料板或进口96孔细胞培养板。
⑵50μl、100μl、300μl微量加样器,灭菌的塑料滴头。
⑶无菌透明胶带,其密度与塑料板一致。
⑷灭菌的离心管
⑸倒置显微镜
2.IBR Baitha—Nu/67弱毒株冻干毒,标准阳性血清,标准阴性血清,均由指定单位供应。
3.细胞培养液
Eagles MEM 45%
0.5%水解乳蛋白-Earle液 45%
犊牛血清 10%
谷氨酰胺 0.03%
青、链霉素各200μg/ml
用7%NaHCO3液调pH6.8~7.0。
(二)操作方法
1.细胞制备 灭菌采取犊牛肾或睾丸,按常规胰蛋白酶消化法制备牛肾(BK)或睾丸(BT)细胞,置37℃温箱培养,长成良好单层细胞备用。一般使用次代细胞,但不超过4代。
2.病毒抗原制备 将IBR Baitha—Nu/67弱毒株冻干毒用LE(0.5%水解乳蛋白—Earle液)作10倍稀释,取长成良好的单层细胞(BK或BT),用Earle’s液洗一次后,按原培养液1/10的量接毒。置37℃温箱吸附1h,然后加入pH7.1~7.2含青、链霉素200g/μgml的LE液至原培养液量,37℃培养,待80%~90%出现典型IBR病变时收获培养物,冻融2次后,3 000r/min离心10min,其上清即为病毒抗原。测定病毒滴度(TCID)并分装小瓶,贮于-70℃备用。半年内滴度保持不变。
3.病毒滴度测定 将制备的病毒抗原,用pH7.0~7.2的LE液作10倍递增稀释至10-7,每病毒稀释滴度液接种细胞培养板4孔,每孔50μl,随后每孔加入细胞悬液(50~60万细胞/ml)10μl和细胞培养液50μl。设4孔细胞对照。用透明胶带封板,置37℃培养。观察1周,每天记录细胞病变情况。
细胞培养半数感染量(TCID50)的确定按Reed-Muench方法计算,即:
TCID50=高于50%死亡率的病毒稀释度的对数 距离比值×稀释倍数(10)的对数。
4.无菌采集被检血清,不加任何防腐剂。各种血清均56℃灭能30min。
5.将一瓶已知滴度IBR病毒抗原,用pH7.0~7.2的LE液稀释成100TCID50/0.05ml,取0.3ml与等量的被检血清于小试管中,37℃温箱中和1h。
6.将已中和的被检血清—病毒混合液加入培养板孔中,每个样品接种4孔,每孔100ul。再于每一样品孔中加入100μl细胞悬液,用透明胶带封板,37℃培养。
7.每次试验时,均设立以下对照:
(1) 标准阳性血清 抗原,标准阴性血清 抗原,其操作程序同试验组。
(2) 被检血清毒性对照:每份被检血清样品接种2孔,每孔50μl,补加细胞培养液50ml,再加细胞悬液100μl。
(3) 细胞对照:每孔加100μl细胞悬液,补加细胞培养液100μl。
(4) 实际使用病毒抗原工作量的测定:将病毒抗原工作溶液(100TCID50/0.05μl)作10倍递增稀释至10-3,每个稀释度接种4孔,每孔50μl,补加细胞培养液50μl,再加细胞悬液100μl。计算本次试验每0.05ml中TCID50的实际含量。
(三)结果判定
1.接种后72h判定结果 当病毒抗原工作液对照、标准阴性血清对照均出现典型细胞病变。标准阳性血清对照无细胞病变,被检血清对细胞无毒性,细胞对照正常病毒抗原实际含量在30~300TCID50时,方能判定,否则被认为无效。
2.判定标准 未经稀释的被检血清能使50%或50%以上细胞孔不出现病变者判为阳性。