(一)双缩脲测定法
1.原理 蛋白质中的肽键有双缩脲反应,在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物,在一定的范围内,颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强,游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应,但此法不够敏感,仅能测出毫克水平。
2.试剂配制
硫酸铜(CuSO4·5H2O)
酒石酸钾钠
H2O 500.0ml
10%氢氧化钠(不含硫酸钠) 300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可长期保存,如产生暗红色沉淀,则应废弃重配。
3.标准曲线的制备
⑴ 准确称取牛血清白蛋白
⑵ 将1%的牛血清白蛋白按表进行稀释:
表 牛血清白蛋白稀释方法表
成 分 |
试 管 号 |
||||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
1%蛋白液(ml) |
1.0 |
.09 |
0.8 |
0.7 |
0.6 |
0.5 |
0.4 |
0.3 |
0.2 |
0.1 |
- |
蛋白含量(mg) |
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
- |
生理盐水(ml) |
0.5 |
0.6 |
0.7 |
0.8 |
0.9 |
1.0 |
1.1 |
1.2 |
1.3 |
1.4 |
1.5 |
双缩脲试剂(ml) |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
试剂蛋白含量(mg) |
8.0 |
7.2 |
6.4 |
5.6 |
4.8 |
4.0 |
3.2 |
2.4 |
1.6 |
0.8 |
0 |
注:1%牛血清白蛋白,经凯氏定氮测定含纯蛋白为80%。
⑶ 混匀后于室温放置0.5h~1h,光电比色(540nm),顺序由低浓度至高浓度,每管测3次,求其平均值。
⑷ 以OD值为纵坐标,蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。
4.样品测定
⑴ 取样品0.1ml,加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml,再加生理盐水0.5ml。
⑵ 加双缩脲试剂4.0ml,混匀,至室温0.5h~1h。
⑶ 另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。
⑷ 测OD540值。
⑸ 根据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。
注意:各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异,一旦标准曲线制定后,样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致,否则结果有差异。
(二)紫外光谱吸收法
1.原理 本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸-色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰,其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高,可测到微克水平,操作简单,不需要加各种试剂,测完后,样品可回收。
2.标准曲线的制备
⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg,溶于50ml生理盐水中。
⑵ 以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg,以盐水对照。
⑶ 测各管OD280值。
⑷ 以OD280值为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
3.样品测定
将待测样品以盐水适当稀释,在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间,以生理盐水为对照,测OD280值,从标准曲线上查出蛋白含量。
(三)Folin酚法
1.原理 蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后,在碱性条件下不稳定,被还原成蓝色的化合物(钼蓝)。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高,且不受溶液中脂多糖的干扰。
2.试剂
试剂甲:
A液:Na2CO3
NaOH
酒石酸钾钠(或钾盐钠盐)
混合、溶于500ml蒸馏水中。
B液:CuSO4·5H2O
H2O 100.00ml
用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。
试剂乙:
于磨口回流瓶加入下列试剂
Na2WO4·2H2O
NaMoO4·2H2O
H2O 700.00ml
85%H3PO4 50.00ml
浓HCl 100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加:
硫酸锂
H2O 50.00ml
溴水 数滴
开口继续沸腾15min,驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色微带绿色(如仍呈绿色,须重复滴加液体溴步骤)。稀释至
3.标准曲线的制备
⑴ 取标准牛血清白蛋白2.50mg,溶于10ml蒸馏水中,使成250μg/ml。
⑵ 按表稀释。
表 标准曲线稀释方法
成分 |
试 管 号 |
||||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
牛血清白蛋白标准品(ml) |
0 |
0.2 |
0.2 |
0.4 |
0.1 |
0.6 |
0.6 |
0.8 |
0.8 |
1.0 |
1.0 |
生理盐水(ml) |
1.0 |
0.8 |
0.8 |
0.6 |
0.6 |
0.4 |
0.4 |
0.2 |
0.2 |
0 |
0 |
蛋白含量(μg/ml) |
0 |
50 |
50 |
100 |
100 |
150 |
150 |
200 |
200 |
250 |
250 |
⑶ 每管加试剂甲5ml,混合后室温放置10min,再加0.50ml试剂乙(即Folin酚试剂),立即摇匀(否则显色降低)。
⑷ 30min后测OD650nm。
⑸ 以OD为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
4.样品测定
⑴ 待测样品1ml(适当稀释至约含25μg-250μg/ml)。
⑵ 加试剂甲、乙。
⑶ 比色、测OD650值。
⑷ 查标准曲线,求蛋白含量乘以稀释倍数,即为样品的蛋白含量。
(四)紫外分光测定法
A1%
A1%
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45OD280-0.74OD260 (此为经验公式,即以不同浓度的蛋白质和核酸混合测定的数值所建立的)。