免疫电泳（Immunoelectrophoresis）

原理

蛋白质是一种两性电解质,它同时具有游离氨基和羧基。每种蛋白质都有它自己的等电点。等电点的高低取决于蛋白质的性质，在等电点时，蛋白质所带的正负电荷相等。在pH大于等电点溶液中，羧基解离多，此时蛋白质带负电荷，带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动。反之，在pH小于等电点的溶液中，氨基解离多，此时蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。

这种带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动，称为电泳。带电质点所以能在电场中移动以及具有一定的移动速度，取决于其本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。

影响电泳的因素

不同带电质点在同一电场中的迁移率（或泳动度）不同，影响迁移率的因素有：①带电质点的性质：即颗粒所带净电荷的量，颗粒大小及形状等。带电荷越多，分子越小，泳动速度越快；②电场强度：电场强度是单位厘米的电位差。电场强度越大，带电质点泳动速度越快。反之亦然；③溶液中pH值：溶液的pH值决定了带电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快。反之则越慢。蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.2～8.8的巴比妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白一般都带负电荷；④溶液的离子强度：溶液的离子强度越高，颗粒泳动速度越慢，反之越快。血清电泳一般最适宜离子强度在0.025～0.075之间。离子强度越低，缓冲液的电流下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低。离子强度太高，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。μ=1/2∑CZ²(μ为离子强度，C为克分子浓度，Z为离子的价数)；⑤电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有SO₄^2-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的γ球蛋白就是如此；⑥吸附作用：即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象而降低了分辨率。纸的吸附作用最大，醋酸纤维膜的吸附作用较小或无；⑦电泳时间：电泳时间与迁移率成正比。

电泳中常用仪器

1．电泳仪

2．电泳槽 一般采用闭合式，即为了防止在电泳过程中产热，而使琼脂凝胶水分过度蒸发的设施。作电极用的铂金丝必须与电泳槽等长，这样电场才能均匀。电泳槽容量不宜过小，以防止溶液的浓度、pH值或离子强度发生改变，影响电泳条件的恒定性。

琼脂的选择和制备

电泳是利用一种支撑物作为一种介质让带电粒子通过，而其本身不发生变化。支撑物一般是采用琼脂或琼脂糖、纤维素膜、滤纸以及聚丙烯酰胺凝胶等。

1．支撑物的条件

⑴惰性物质，电泳后本身不发生变化。

⑵制成凝胶后，其分子排列均匀，孔径大小一致便于带电质体自由通过。

⑶透明、无杂质、电渗作用小，并且有一定的粘度与脆性。

⑷价格便宜。

一般多用琼脂粉或琼脂糖。琼脂糖是琼脂粉进一步提炼而成，很少或几乎无电渗作用。

2．凝胶板的制备 称取所需要量的琼脂粉，加入缓冲液（琼脂浓度一般1%～2％，琼脂糖0.75%～1.5％），同时加万分之一的硫柳汞防腐。水浴煮沸，待琼脂完全溶化后，液体清凉，再煮一段时间。选择适当大小的、无油腻、无划痕的干净玻璃板，根据所需的厚度（一般为2mm～4mm厚），计算好琼脂的用量。把玻片置于事先用水准仪测试的平台上，倒入熔化的琼脂，注意不要产生气泡。冷却后，按事先制好的图形大孔，用点水笔尖挑去孔内的琼脂，在火焰下轻烤以封底，以防止样品从琼脂底部泳过。然后加样，不用的琼脂板，放入冰箱中，注意防止干涸和冰冻。

缓冲液的选择与配制

常用的电泳缓冲液有以下两种。

1． pH8.6离子强度0.025Mol/L～0.075Mol/L的巴比妥缓冲液，配制方法如表：

表 巴比妥缓冲液配制

2．pH8.6硼酸缓冲液，离子强度0.05Mol/L

硼酸 6.70g

硼砂（Na₂B₄O₇·10H₂O） 13.40g

H₂O 加至 1 000ml

缓冲液配制后，加万分之一的硫柳汞防腐。两侧电泳槽加缓冲液至2／3～4／5的槽体积，注意两侧一样多，以免造成液面差，产生虹吸作用，影响电泳。

当蛋白质泳动至槽内后，就应该更换缓冲液。有人认为长久电泳过的电泳液易于把血清中各成分分开，而新配制的则差一些。为了防止缓冲液离子强度的改变，可以在每次电泳时更换正负极（这是目前广泛采用的）；也可以在下一次电泳前，将两槽内的缓冲液混合后再用。但也有人认为不能混合再用，必须更新。

电场强度的显示

以V／cm长或I／cm宽表示。电压的测量必须用电压表测量凝胶板两端的电压差，再除以板长，而不能以电泳仪上的电压数表示，当然这两者有一定的相关性。电泳仪上的电流强度除以凝胶板宽即可代表电场强度。在实际工作中，很难有两项指标都符合的调控，因此只能根据取其一个指标进行调控，一般多按电流计算。

结果观察与标本的保存

对于与免疫有关的电泳，一般能形成明显的抗原抗体复合物，因此可以直接观察。也可以染色观察。染色后同时也起到了保存标本的作用。具体步骤如下：

1．将琼脂板放入生理盐水中4℃浸泡2天～3天，每天换液数次，以洗去多余的蛋白质。

2．染色 将洗好的琼脂板放入氨基黑或偶氮胭脂红染色液中染色15min～30min。

0.5％氨基黑染色液的配制：

氨基黑4B（10B也可） 0.50g

甲醇 5ml

冰醋酸 10ml

H₂O 40ml

0.75％偶氮胭脂红染色液的配制：

偶氮胭脂红 1.50g

甲醇 100ml

冰醋酸 20ml

H₂O 80ml

先将染料放入研钵中，边研磨边加甲醇，使染料充分溶解，再加冰醋酸，最后加蒸馏水，以滤纸过滤，置棕色瓶保存。

3．脱色 染色后，将琼脂板放入脱色液中脱色，至琼脂板底色脱净为止，脱色液要勤换。

脱色液的配制：

乙醇 45ml

冰醋酸 5ml

H₂O 50ml

脱色液用过后，可用活性炭吸附染色颗粒，过滤后，可再使用。

4．漂洗 用蒸馏水漂洗。

5．制膜 把琼脂胶滑到玻璃纸上，下垫一玻璃块，展平玻璃纸。在琼脂表面上抹一层甘油（以防干裂），放37℃温箱烘干即可。也可以先制膜后染色。

对于非免疫性电泳标本的染色基本同于免疫电泳。但不要进行漂洗，电泳后直接投入染色液中或固定后投入染色液中。

6．标本的保存 主要是染色后拍照保存，也可制膜保存。

电泳的分类

1．根据支撑物的不同可分为：

⑴凝胶电泳：如琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

⑵纸或纤维素膜电泳：如滤纸电泳、醋酸纤维膜电泳、硝酸纤维素膜电泳等。

⑶粉末电泳：如淀粉、纤维素粉电泳等。

2．根据电场强度的不同可分为：

⑴低压电泳：电场强度1V/cm～5V/cm，电泳时间较长，可数小时至十几小时。

⑵中压电泳：电场强度5V/cm～20V/cm，电泳时间一般数分钟至数十分钟。

⑶高压电泳：电场强度20V/cm～200V/cm，电泳时间短，一般为数分钟至数十分钟。

3．根据离子强度的不同而分为：

⑴连续电泳：是指电泳槽缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的一致。

⑵非连续电泳：使电泳槽内缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的不一致。一般常采用琼脂板的离子强度为电泳槽的一半。

4．根据电泳的目的可分为：区带电泳、免疫电泳 胞电泳等

5．根据形状可分为火箭电泳、圆盘电泳等。