交联法
交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万),酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP的制备:将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液
⑵ 二步法:是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作:将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液,混合后
改良HRP二步标记法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml,
氧化法
采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。
(1)氧化法操作过程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在
(2)改良过碘酸钠法:①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml,混匀,置
戊二醛法与过碘酸钠法比较
比较项目 |
戊二醛法 |
过碘酸钠法 |
|
一步法 |
二步法 |
||
标记方法 |
简单 |
较复杂 |
较复杂 |
酶利用率 |
2~4% |
2~4% |
70%酶偶联到99%抗体上 |
产率 |
<5% |
<5% |
>50% |
标记抗体分子量 |
750万 |
<25万 |
>40万 |
穿入组织能力 |
差 |
好 |
一般 |
抗体活性丢失 |
多 |
少 |
较多 |
酶活性丢失 |
多 |
少 |
较多 |
染色效应 |
差 |
较好 |
较好 |
二马来酰亚胺法
二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α-巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。具体操作如下:将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα-巯基乙胺在