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酶标记方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-06-28

交联法

交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm3时,即为好的交联剂。

戊二醛交联法又分为一步法和二步法。

一步法:即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16),酶分子量小(4),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:①抗IgGAKP的制备:将10mgAKP溶于含有5mgIgG1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS4充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛,4保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgGHRP的制备:将12mgHRP溶于含5mgIgG1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8),缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分装后保存于低温冰箱,避免反复冻融。或冷冻干燥保存。

二步法:是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作:将10mg的酶溶于0.2ml1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液,混合后4冰箱放置24h,加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,离心去沉淀,上清液即为酶结合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步标记法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml37温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml2 500r/min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解,加入0.5ml~1ml IgG抗体溶液(含抗体15mg左右),放在冰箱内过夜后,加KH2 PO4,使近中性即可应用。

氧化法

采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。

1)氧化法操作过程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在40.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中),室温置2h~3h,加入5mg氢化硼钠(NaBH4),于4冰箱放置3h或过夜,然后用PBS液充分透析,离心去沉淀物。上清液即为酶结合物,纯化后使用。

2)改良过碘酸钠法:①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml,混匀,置430min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O 0.09ml乙二醇)0.5ml,室温放置30min;③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜),使之结合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀,置42h;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,430min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,装入透析袋,以同样液体在4透析除盐过夜;⑥次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体(HRPIgG)结合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后,加入等量优质甘油,分装小瓶,低温保存。

戊二醛法与过碘酸钠法比较

比较项目

戊二醛法

过碘酸钠法

一步法

二步法

标记方法

简单

较复杂

较复杂

酶利用率

24%

24%

70%酶偶联到99%抗体上

产率

5%

5%

50%

标记抗体分子量

750

25

40

穿入组织能力

一般

抗体活性丢失

较多

酶活性丢失

较多

染色效应

较好

较好

二马来酰亚胺法

二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α-巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用NN-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。具体操作如下:将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,IgG(14mg/2ml)10mlα-巯基乙胺在37温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml3.0mg左右的还原抗IgG。在0,11滴加饱和NNO-苯二马来酰亚胺溶液,混合,于30温育20min,过SephadexG25柱,除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置3020min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于424h~72h,再过Sepharose-6B(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物,加叠氮钠(NaN3)防腐,4保存备用。

 

 
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