1．标记酶的选择条件
⑴ 活性高，分解底物的能力强。
⑵ 特异性强，即作用于底物的专一性强。
⑶ 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。
⑷ 与底物作用可以显色。
⑸ 纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。
⑹ 可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。
⑺ 测定方法简单。
⑻ 酶来源方便、价格低廉。
2．符合条件的酶
⑴ 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。
⑵ 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。
其中以HRP最为常用，因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。
3．辣根过氧化物酶 HRP广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含糖量18%，它由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。分子量40 000，等电点5.5～9.0之间，它催化的最适pH因供氢体不同而有所差异，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。
HRP酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为275nm，辅基部分的最大吸收光谱为403nm，二者比值OD403/OD275为酶的纯度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ＞3为高质量，RZ＞2.5为中等质量，RZ＜2.5则需要纯化。RZ值越小，表示杂蛋白越多,如RZ为0.6，则表示有75%的杂蛋白。
衡量酶质量的标准有两条，一个是纯度即RZ值，一个是活力。只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定,酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下(pH、温度和底物浓度)一分钟能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。
用作标记的过氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4．HRP的作用底物与供氢体 底物为H2O2，催化时需供氢体。
⑴ 组化法常用的供氢体是3，3′－二氨基联苯胺盐酸盐(3.3－diamino－benzidine . DAB)。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇(OSO4)形成具有电子密度的产物，可适用于电子显微镜观察。
⑵ 用于ELISA的供氢体有下列数种。
表 ELISA的供氢体
|
供 氢 体 |
反应颜色 |
波长 |
终止剂 |
终止 颜色 |
测定波长 |
|
联大茴香胺(OD) |
桔红 |
512 |
5Mol/L HCI |
黄 |
400 |
|
邻苯二胺(OPD) |
黄 |
444 |
2Mol/L H2SO4 |
桔黄 |
492 |
|
邻苯甲苯胺(OT) |
兰 |
636 |
2Mol/L H2SO4 |
黄 |
442 |
|
5－氨基水杨酸 |
褐 |
475 |
1Mol/L NaOH |
褐 |
449 |
以OD和OPD最为常用。OPD有致癌作用，使用时需注意。
5．碱性磷酸酶 可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶,其作用是催化磷酸－脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。