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EAC玫瑰花环试验

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-06-28

原理

B淋巴细胞表面具有补体C3受体,红细胞可与相应的抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物(EA),以红细胞作为指示细胞,通过补体传统途径活化补体,而产生活化的C3,然后与活化的C3结合形成花环,以供计数B淋巴细胞。

材料与试剂

1.鸡红细胞悬液的制备 由于绵羊红细胞易与T淋巴细胞形成E—玫瑰花环,易造成混淆,所以一般在检测B淋巴细胞时,采用鸡红细胞。从鸡翼下静脉采血,用肝素抗凝,以Hank’s洗涤2次备用。

2.抗鸡红细胞抗体的制备 2kg3kg的健康家兔,以Hank’s液洗过的压积红细胞进行免疫,每日背部皮下注射1次,共注5次,注射量为0.5 ml1.0 ml1.5 ml2.0 ml2.5ml。第六次改用静脉注射50%压积红细胞悬液1ml,一日一次,连注3天。末次注射后7天试血,测定红细胞的凝集效价,以出现“ ”的最高抗血清稀释度判定为血凝效价。效价达12 000以上者为合格。应用时采用凝集价的12(亚凝集价)作为抗血清的稀释度(即14 000)。

溶血素的效价测定

试验组

对照组

管号

1

2

3

4

5

6

7

8

溶血素稀释倍数

10

102

103

2×103

3×103

4×103

5×103

1 %红细胞量(ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

溶血素量(ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.9%盐水(ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

混匀,37感作1h

结果判定

-

-

-

-

3.补体 当日采集豚鼠混合血清,用Hank’s液稀释成1100,置4保存备用。

4.无Ca2 Mg2 pH7.2Hank’s

5.姬姆萨染液

61%戊二醛溶液

操作方法

1.分离淋巴细胞,制成约2.5×106个/ml悬液。

2EAC悬液的制备 4%鸡红细胞2ml于试管中,加入14 000的鸡溶血素2ml,混匀,置37水浴15min,取出后离心,用Hank’s液洗涤2次,再用Hank’s液恢复至4%红细胞2ml,加入等量的1100稀释补体,混匀,再放置37水浴15min取出,用Hank’s液洗涤2次,配成4EAC细胞悬液。

3.取淋巴细胞悬液0.2ml,加入4EAC细胞悬液0.2ml,混匀,室温或20作用30min1 000r/min离心5min,吸弃过多的上清液,放入42h4h

4.取出后,将沉淀轻轻摇起,加1%戊二醛0.1ml,混匀后置4固定30min

5.以悬液制片,自然干燥,滴加姬姆萨液染2min,加自来水继续放置15min,冲洗,将玻片置95%酒精缸脱色15sec~30sec(以脱成浅紫蓝色为度),再置盐酸液缸(按1HCl 1份与自来水2份)脱色(呈淡兰略带红色为度)10sec左右,取出冲洗,干后镜检。

结果判定

凡一个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EAC花环形成阳性细胞。共计数200个淋巴细胞,计算花环形成率。

注意事项

1.加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以140为宜(130150),淋巴细胞过少,花环形成率明显减少。

2.淋巴细胞、红细胞、补体均应新鲜,否则花环形成率明显下降。

3.据认为小鼠补体比豚鼠补体更为好,小鼠血清中胶固素活化因子(KAF)含量较多,可使大部分C3裂解而不易引起溶血。

 
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