原理
B淋巴细胞表面具有补体C3受体,红细胞可与相应的抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物(EA),以红细胞作为指示细胞,通过补体传统途径活化补体,而产生活化的C3,然后与活化的C3结合形成花环,以供计数B淋巴细胞。
材料与试剂
1.鸡红细胞悬液的制备 由于绵羊红细胞易与T淋巴细胞形成E—玫瑰花环,易造成混淆,所以一般在检测B淋巴细胞时,采用鸡红细胞。从鸡翼下静脉采血,用肝素抗凝,以Hank’s洗涤2次备用。
2.抗鸡红细胞抗体的制备 选
溶血素的效价测定
试验组 |
对照组 |
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管号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
溶血素稀释倍数 |
10 |
102 |
103 |
2×103 |
3×103 |
4×103 |
5×103 |
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1 %红细胞量(ml) |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
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溶血素量(ml) |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.9%盐水(ml) |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
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结果判定 |
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- |
- |
- |
- |
3.补体 当日采集豚鼠混合血清,用Hank’s液稀释成1︰100,置
4.无Ca2 、Mg2 pH7.2的Hank’s液
5.姬姆萨染液
6.1%戊二醛溶液
操作方法
1.分离淋巴细胞,制成约2.5×106个/ml悬液。
2.EAC悬液的制备 取4%鸡红细胞2ml于试管中,加入1︰4 000的鸡溶血素2ml,混匀,置
3.取淋巴细胞悬液0.2ml,加入4%EAC细胞悬液0.2ml,混匀,室温或
4.取出后,将沉淀轻轻摇起,加1%戊二醛0.1ml,混匀后置
5.以悬液制片,自然干燥,滴加姬姆萨液染2min,加自来水继续放置15min,冲洗,将玻片置95%酒精缸脱色15sec~30sec(以脱成浅紫蓝色为度),再置盐酸液缸(按1%HCl 1份与自来水2份)脱色(呈淡兰略带红色为度)10sec左右,取出冲洗,干后镜检。
结果判定
凡一个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EAC花环形成阳性细胞。共计数200个淋巴细胞,计算花环形成率。
注意事项
1.加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以1︰40为宜(1︰30~1︰50),淋巴细胞过少,花环形成率明显减少。
2.淋巴细胞、红细胞、补体均应新鲜,否则花环形成率明显下降。
3.据认为小鼠补体比豚鼠补体更为好,小鼠血清中胶固素活化因子(KAF)含量较多,可使大部分C3裂解而不易引起溶血。