基本原理
玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E—玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体,因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中,以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体,所以不能形成E—玫瑰花环,以资鉴别。
材料与试剂
1.肝素抗凝剂
2.淋巴细胞分层液 配制方法见细胞分离技术。
3.无Ca2 、Mg2 Hank’s液
NaCl 4.00g
NaHCO3 0.175g
KCl 0.20g
Na2HPO4.12H2O 0.076g
KH2PO4 0.030g
葡萄糖 0.50g
H2O加至 500.00ml
用5.6%NaHCO3调pH至7.2,115℃15min灭菌。4℃贮藏备用。
4.5.6%NaHCO3液
NaHCO3 5.60g
H2O 100.00ml
115℃20min灭菌, 4℃贮藏备用。
5.0.8%戊二醛溶液
25%戊二醛溶液 0.32ml
Hank’s液 9.68ml
用前配制。
6.Giemsa—weight染色液
Giemsa粉 0.03g
Weight粉 0.30g
甲醇 100.00ml
先将染料一起放入研钵内,加入少量甲醇,研磨细,然后倒入瓶内,并用甲醇冲洗研钵内染料,一起倒入玻瓶内,补足甲醇量,备用。
操作方法
1.取肝素抗凝血2ml,置37℃水浴自然沉淀30min~40min,吸取全部血浆(约1ml)。
2.于血浆中加Hank’s液数毫升,洗涤,1 500r/min离心5min~10min,弃上清。重复洗涤4次,沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。
3.采绵羊肝素抗凝血,加数倍Hank’s液,洗涤3次,最后以Hank’s配成10%悬液,4℃保存。
4.取0.1ml淋巴细胞悬液,加10%红血球悬液0.1ml,加小牛血清0.1ml。
5.37℃水浴10min,低速离心(600r/min)5min。
6.吸弃多余的上清液后,放入4℃冰箱2h~4h。
7.取出后,将沉淀轻轻摇起,加0.8%戊二醛0.1ml,混匀后4℃固定15min。
8.将干净的玻片用Hank’s液沾湿,滴一小滴混悬液,让其自然散开即可。
9.自然干燥后,用姬姆萨—瑞氏液(Giomsa—weight)或苏木精—伊红染色,水洗,干燥镜检。
结果判定
凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为一个E—玫瑰环。检查200个淋巴细胞,计算其玫瑰花环形成率。
注意事项
1.影响E—玫瑰花环试验最主要的因素淋巴细胞和红细胞的新鲜程度,被检血样必须新鲜,无菌,采血后要求在3h~4h内进行检验,否则由于淋巴细胞的死亡,受体脱落,影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周,且不应溶血。
2.控制好反应温度、时间等条件对玫瑰花环形成率有较大影响。选37℃作用10min,低速离心5min,置4℃ 2h~4h,其结果稳定性较好,结合率较高。如在37℃作用时间较长,可见玫瑰花环发生变形,结合部位松弛、拉开,甚至解离。
3.指示红血球的动物种类也与玫瑰花环的形成率有关。如马淋巴细胞与豚鼠红细胞结合较好,而驴则与绵羊红血球结合较好。Melinda氏报道,人、马、牛、猪、狗、猫、鼠与豚鼠红细胞的结合率都高于绵羊红细胞的结合率。
4.加犊牛血清能增加玫瑰花环形成细胞的稳定性,增强与指示红细胞结合的牢固性。
5.Hank’s液的pH以7.2~7.4为宜。