又称孟德尔第一定律。生物体在形成配子过程中，位于某对同源染色体的一对等位基因，随着同源染色体的分开而彼此分离，并进入不同的配子中，独立地随配子传递到后代。例如将开红花的纯系豌豆品种与开白花的纯系豌豆品种进行杂交，其F1全部表现为开红花，F1自交所得的F2中有705株开红花，224株开白花，两者数目之比大致为3∶1。豌豆的其他6对相对性状均有类似结果，如下表所示：
它们的共同点是：（1）F1只表现某一亲本的性状（显性性状）；另一亲本的性状（隐性性状）则不表现。（2）在F2，杂交亲本的相对性状——显性性状和隐性性状均得以表现，二者之比约为3∶1。对此，孟德尔提出遗传因子假说来解释，其要点是：（1）相对性状的遗传由相对的遗传因子（现称为基因）控制。例如，在豌豆花色试验中，遗传因子C控制开红花，而遗传因子c则控制开白花，C对c呈显性。（2）遗传因子在体细胞中成对存在，每对因子中1个来自父本，另一个来自母本。豌豆开红花显性亲本的遗传型为CC，开白花隐性亲本为cc，F1为Cc，由于C对c为显性，所以F1表现为开红花。（3）杂合体（如Cc）的遗传因子彼此不融合而保持相对独立，在形成配子时，成对遗传因子彼此分离，进入不同的配子，因此每个配子只含有成对因子中的一个成员，于是产生了数目相等的两种配子，即C配子和c配子。（4）雌、雄配子的结合是随机的，按概率法则，各类合子出现的概率是雌、雄配子概率的乘积。
F2代的遗传构成为1/4CC、2/4Cc、1/4cc，但由于CC和Cc都开红花，所以，开红花与开白花个体数之比为3∶1。可见分离规律的实质是：两个不同的等位基因分别位于一对同源染色体上，在形成配子时，等位基因随着同源染色体的分开而彼此分离，分别进入不同的配子，产生两种数目相等的配子，雌、雄配子的随机结合，使F2的基因型比例数为1∶2∶1，而表现型个体数之比是3∶1。为验证F1在形成配子时确实由于等位基因的分离而产生C和c两种数目相等的配子，孟德尔首创了测交法，即把待测的杂合体与隐性亲本进行测交。如果F1在形成配子时等位基因确实分离，那么测交后代的开红花数与开白花数之比应为1∶1，实验结果果然如此：
孟德尔对7对相对性状均做了测交，测交后代的显性个体数与隐性个体数之比均为1∶1，与预期结果相符，从而说明他的遗传因子假说是正确的。分离规律在生物界有普遍意义，各国学者用动、植物做了许多杂交试验，都得到类似于孟德尔的结果。例如，用纯合体的黑色豚鼠CC与白色豚鼠cc杂交，其F1均为黑色，F1互交产生的F2群体中出现黑色个体数：白色个体数为3∶1。又如在人群中，有耳垂者的基因型为AA或Aa，无耳垂者为aa，综合分析多个双亲均为杂合体的家庭子女的耳垂性状，发现有耳垂者与无耳垂者数目之比亦为3∶1。
分离规律的出现是有条件的，这些条件是：（1）研究的对象必须是行有性生殖的二倍体生物，所研究的性状为质量性状。（2）控制性状的显性基因对隐性基因呈完全显性，并且非等位基因之间无互作。（3）减数分裂时，该基因座上的两个等位基因必须分开到不同的子细胞中，所形成的两类配子数目相等，受精时各类雌雄配子随机结合。（4）受精卵或由受精卵发育而成的个体具有同样的成活率。（5）分析的群体必须比较大或试验次数较多。有时上述条件都得到满足，在F2中仍会出现偏离3∶1的现象，这是由于随机抽样误差和概率分布（因理想群体中各类型的出现是由机率决定的，因而出现实得比例在预期比例左右波动的现象）等原因所致。
掌握分离规律有助于正确认识生物遗传现象。在动、植物良种培育工作中，利用分离规律可促使个体基因的分离和个体基因型的纯合化，从中选出符合育种目标的遗传上稳定的类型。例如有些作物（如小麦）的抗病性有的是由显性基因控制的（R表示抗病基因，r表示感病基因），表现为抗病植株的基因型为RR或Rr，为选出抗病的纯合植株，须将选得的抗病植株自交后加以考查，看其后代是否分离，如不分离，才能选出RR型纯合株，以保证它们的后代是抗病的。分离规律也是医学和优生学的理论基础。据统计，目前已发现的遗传病近5000种，遗传病患者占人口的10％，其中大部分为单基因遗传病，应用分离规律可探索这类遗传病的发病特点，以便作出准确诊断和采取相应防治措施。例如，人结肠息肉病是单基因显性遗传病，并且可能导致癌变，先证者往往是杂合子，如果与正常人婚配，根据分离规律可预测其子女的发病率为1/2，因此应及早对其子女进行钡餐透视，采取措施以避免结肠癌变的发生。
