植物基因克隆技术及其发展

基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象，开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理，对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入，近年来其研究方法不断改进，新技术不断涌现，这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。
一、常用的目的基因克隆技术
　　1、通过已知基因产物的分析和鉴定
　　这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。
　　2、通过遗传表型分析
　　（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。
　　（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编码的激发子与寄主抗病基因编码的受体之间存在不亲和的互作关系，以病原激发子蛋白为线索分离和克隆出一些几丁质抗病基因，如番茄与无毒基因avr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。
　　3、以图谱为基础的定位克隆技术
　　以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。
二、发展中的基因克隆新技术
　　1、从研究缺失突变体的表型着手分离基因
　　（1）核DNA消减法。该法主要是利用许多缺失突变体与其未缺失的同源亲本只有1-2个DNA片段的差异，通过将大量特殊标记的突变体DNA与少量未缺失亲本DNA相混合，变性后在适当温度下复性，待反应体系中的单链DNA重新配对成双链后，除去标记的突变体DNA和与之杂交配对的亲本DNA。如此几轮选择后，反应体系中最后只剩下在突变体核DNA中所缺失的那一段亲本DNA，最后对亲本特异DNA片段进行克隆。
　　(2)核DNA消减--PCR法。该法是核DNA消减法的发展，它将经特定限制性内切酶处理的未缺失亲本DNA（备测DNA）与大量经超声波切割、光敏生物素标记的突变体DNA(减法探针DNA)混合，经变性复性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球悬浮液除去各种杂合体，富集的亲本特异性DNA再经几轮筛选后加接头序列和T4DNA连接酶，然后加入单链接头序列作PCR引物进行PCR扩增，最后PCR产物直接克隆或32P标记后作探针与亲本DNA或核DNA文库杂交，确定出这些DNA片段所编码的基因，应用上述方法已分离出拟南芥菜与赤霉素合成有关的基因gal以及冰草的盐胁迫诱导基因等。
　　2、从大的基因组区域直接分离编码序列
　　真核生物基因组DNA中只有很小一部分编码mRNA，而大部分则为内含子、外显子和重复序列，目前通过大规模基因组测序来寻找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分离表达序列的方法中，cDNA捕捉法是较成功的一种方法，已用于许多基因的定位克隆。
　　（l）cDNA文库差示筛选法，这是一种直接分离组织或发育特异表达基因的方法，例如对于两种不同的组织细胞，先提取它们的poly(A) mRNA，分别构建这两种组织的cDNA文库，然后以这些mRNA为模板，合成放射性标记的cDNA探针，再用这两种探针分别与一类cDNA文库的两套重复考贝杂交，跟两种探针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基因，而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的mRNA，再对这样的克隆进行测序比较和鉴定，就可分离到这种组织特异表达的基因。用这种方法已分离到许多根茎叶和生殖器官等特异表达的基因。
　　(2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一种以表达为基础的基因分离技术。它直接用基因组DNA如酵母人工染色体(YACs)捕捉cDNA片段，从而达到快速地从大的基因组区域分离表达序列。其主要技术是用PCR扩增来自不同组织的混合cDNA池或已克隆的cDNA文库，扩增的cDNA片段与用生物素随机标记的基因组目标DNA杂交，捕获亲和素标记磁珠上的与目标DNA杂交的cDNA片段，然后洗脱磁钵上捕获的cDNA并进行PCR扩增，再进行第二轮筛选，并将筛选出的cDNA片段克隆到载体上。
　　3、通过研究mRNA差异表达筛选克隆基因
　　1992年粱鹏等在mRNA差异表达通用方法即mRNA差减杂交技术基础上建立了mRNA差异显示反转录PCR技术(DDRT-PCR)，由于该技术所存在的缺陷和不足，已有许多研究在引物设计、Northern杂交和凝胶测序等方面对该技术进行了改进和优化，已发展了许多衍生的新技术，如用随机引物PCR扩增RNA指纹分析(RAP)、顺次差异显示法(ODD)、基因组差异显示法(GDD)、RC4D(RFLP一Coupled domain一direted DD)等。
　　mRNA的差异显示法已在发育和生理过程中差异表达基因的克隆方面得到广泛的应用，特别适用于进行数种平行材料之间的比较筛选。应用RC4D法可分析植物发育过程中某一组织的某一特定多基因家族不同成员的差异表达，如已从玉米花序中分离出6个雌雄花序中差异表达的MAD-box基因，从小麦和拟南芥中分别分离出HSP家族基因。
　　4、表型克隆法
　　表型克隆法是以mRNA为起始材料，利用RT-PCR和接头技术，对差异显示的基因带纹进行回收后作探针，在cDNA或基因组DNA文库中扫描筛选新的基因。这方面最新发展起来的技术主要有：cDNA差式分析法(RDA)、标签接头竞争PCR技术（ATAC一PCR）、抑制消减杂交法(SSH)、基因表达连续分析法(SAGE)、cDNA3端限制酶切片段显示法(RFD)等，这些技术省去了分子标记定位分析的繁琐程序，并同时能分离多个未知产物的差异表达基因。
　　5、应用DNA芯片技术筛选新基因
　　DNA芯片技术是利用核酸杂交原理检测未知分子。它是由核酸片段如一系列用特定荧光标记的寡核苷酸探针，以预先设计排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成生物集成膜片，与不同标记的游离靶分子（DNA 或RNA）杂交，或生物集成膜片上的不同靶分子与游离的探针杂交，然后应用荧光信号检测器及处理器根据杂交分子或未杂交分子所发出的不同波长的光检测杂交信号。如完全杂交则发出强的荧光信号或特殊波长信号，不完全杂交信号较弱，若不能杂交则检测不到荧光信号或只检测到芯片上原有荧光信号。这些不同区域的荧光信号在芯片上组成荧光分布谱型，可被激光共聚焦显微镜激发和检测，经电脑软件处理检出DNA的序列及其变化。例如斯坦福大学从外周血淋巴细胞cDNA文库中用PCR法扩增插入基因，得到1046种未知序列扩增产物，将这些扩增产物作为靶DNA点样到经包被的玻片上，制成DNA芯片，经SDS、NaBH4等处理，95℃热变性后分别与热击T细胞及未处理T细胞的cDNA杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，其余6个是被热击抑制的，经序列分析表明其中3个为未发现的新基因。植物上最近已有应用cDNA芯片对草莓、矮牵牛进行基因表达的检测。
　　DNA芯片技术在发现新基因及分析各个基因在不同时空表达方面是一项十分有用的技术，已有学者对其在农业上的应用作了展望，如应用DNA芯片技术有望更深入地了解植物生长发育的内在机制、植物生长激素的作用机制、转基因工程株的实验室快速分析、了解小分子对基因表达的影响及加速DNA多态性的检测等。
　　综上所述的各种植物未知基因分离克隆技术，其研究和分析对象各有侧重且各有优缺点，有的在植物基因资源的研究开发上应用比较成熟，有的正逐渐应用到植物上。毫无疑问，发展中的这些植物基因分离技术在植物的分子生物学和基因工程中有着巨大的应用潜能，随着新的基因资源的不断发掘，作物的许多性状诸如产量、品质、抗性，植株的形态、熟期、花器发育的调节，以及一些复杂的生理生化性状等都可望得到进一步的改良。