Southern 杂交鉴定

1） 取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL,1.0%凝胶,)
2) 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照
记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。
3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)
A． 将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。
B．用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
C．将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。
D．将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。
重复D一次。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。
4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台
5) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。
另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。
准备10 X SSC 转移液。
将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。
6）安装毛细管转移装置
A．将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。
B．将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。
C．将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。
D．用保鲜纸封住凝胶四边。
E．将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。
F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一
玻璃板，其上压一重物。
G．转移几小时或过夜(至少4小时)
注意：勿使转移液干枯。
7)已转移的DNA与膜交联
A．将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。
B．将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。
C．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。
此膜可在4oC长期保存。
8)DNA探针的制备(略过)
参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。
9）印迹的预杂交
将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42 oC预热。
放入印迹膜,在42 oC预杂交30min。
10)准备探针
水煮地高辛标记的探针5min使变性, 并立即放在冰上2min.
11) 加适量的探针到已预热的杂交液中,混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)。
42 oC杂交至少4小时或过夜。
注意: 不要将探针直接加在印迹膜上，而应加在容器一角的预杂交液中
12）印迹膜的冲洗：
A．将杂交液倒出，储存起来可再次使用。
B． 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次,每次5min .
C． 用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC摇动洗膜2次,每次15min (用杂交炉).
13)免疫检测:
A. 用10mL冲洗液洗膜1-5min.
B. 膜在15mL阻断液中孵育30min
C. 膜和8mL抗体孵育30min
D. 在15mL冲洗液中洗膜2次,每次15min.
E. 在15mL检测液中平衡2-5min.
14)将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上,滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜; 然后,立即
用保鲜纸包裹, 挤掉多余的CSPD ready-to-use,使其均匀平铺在膜上,没有气泡, 但避
免使膜干掉. 室温孵育5min.
15)在37 oC孵育潮湿的膜10min,增强发光.
16)用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min.
(发光性能至少可持续48小时)
17) X-光底片的冲洗
Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片